Một số phương pháp nuôi cấy mô Lan Mokara

II. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in – vitro

5. Một số phương pháp nuôi cấy mô Lan Mokara

t. Nhân giống Mokara bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Quy trình

Chọn cây mẹ

34 Khử trùng

Bằng cồn 700C và HgCl2 0,1%

Lấy đỉnh sinh trưởng

Kích thước 0,1 – 1mm

Môi trường tạo thể chồi

Ánh sáng 4000 lux, chiếu sáng 12h/ngày

Cụm chồi

Môi trường duy trì

Cụm chồi phát triển Tạo rễ

Cây con

Cây con 5 – 7cm, 3 -4 lá Chuyển ra vườn ươm

* Thuyết minh quy trình:

- Chọn những cây khoẻ, sạch bệnh, sinh trưởng và phát triển tốt.

- Lấy chồi ngọn mang đỉnh sinh trưởng. Tiến hành khử trùng: rửa bằng nước xà phòng rồi rửa sạch xà phòng. Rửa bằng nước cất vô trùng 2 – 3 lần trong bình vô trùng. Ngâm trong cồn 70 trong thời gian 30 giây. Rửa lại bằng nước cất 3 -5 lần. Ngâm trong HgCl2 0,1% trong thời gian 3 – 10 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 – 10 lần.

35 - Tiến hành dùng dao đã khử trùng tách bỏ lớp vỏ ngoài rồi tách lấy 0,1 – 1 mm mô phân sinh và đưa vào môi trường nuôi cấy có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp với các chất kích thích tế bào sinh trưởng, nuôi cấy dưới điều kiện ánh sáng 4000 lux, chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ 28 – 300C

- Sau 4 – 8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn như hạt đậu xanh gọi là protocorm.

- Tách các protocorm trong điều kiện vô trùng và cấy lên môi trường dinh dưỡng để tạo chồi, thân, lá, rễ.

- Sau một thời gian cây đã được tái sinh hoàn chỉnh. Chuyển ra vườn ươm. Rửa sạch agar rồi trồng lên giá thể (dớn băm mịn). Sau một tháng khi cây có rễ thật thì chuyển sang sang túi P.E hay chậu sành đựng dớn băm. Sau đó chuyển sang chậu lớn trong nhiều lần và chăm sóc như Lan thông thường.

u. Nhân giống Mokara bằng phương pháp nuôi cấy phát hoa cũ

Quy trình

Mẫu cấy

Cành hoa

Mắt ngủ của cành hoa Đỉnh ngọn của cành hoa

Khử trùng

Bằng cồn 700C và HgCl2 0,1% Protocorm, chồi

36 Nhân nhanh

Cấy chuyền

Cây giống in – vitro

Vườn ươm * Thuyết minh quy trình

- Chọn các đỉnh ngọn của cành hoa non hay các đốt mang mắt ngủ của cành hoa đã nở hết, cắt cành hoa thành các đoạn dài 3 – 4 cm có mang mắt ngủ. Sau khi đã cắt mẫu ta tiến hành rửa mẫu bằng xà phòng dưới vòi nước. Sau đó tiến hành rửa bằng nước cất vô trùng 3 – 5 lần tiếp tục rửa bằng cồn 700 trong thời gian 30 giây, tiếp tục rửa bằng nước cất 3 – 5 lần. Tiến hành khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 4 – 10 phút, rồi rửa lại bằng nước cất vô trùng từ 5 – 10 lần. Tiến hành cắt bỏ hai đầu mẫu cấy và giữ lấy đoạn thân có chứa mắt ngủ dài 1 cm. Ta tiến hành cấy vào môi trường đã chuẩn bị sẵn (môi trường nhân giống cành hoa có chứa mắt ngủ. Đỉnh ngọn cành hoa cấy vào môi trường nhân đỉnh ngọn của cành hoa.

- Sau khi các đoạn thân này phát triển thành protocorm ta tiến hành nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh. Chuyển các protocorm sang môi trường nhân nhanh. Để tạo số lượng mẫu lớn thì trong quá trình nhân nhanh ta nuôi cấy các lát mỏng của thể tiền chồi non trên môi trường có bổ sung cac chất điều hoà sinh trưởng thích hợp. Sau thời gian nuôi cấy kích thước của cây đạt (5 – 7 cm) ta tiến hành cấy

37 chuyền. Sau khi đã tạo thành cây giống in – vitro có kích thước (5 – 7 cm) tiến hành chuyển ra vườn ươm.

v. Một số điều cần lưu ý khi sử dụng phương pháp nuôi cấy mô

- Thời gian và số lần nuôi cấy càng nhiều thì khả năng phát triển của mô nuôi cấy càng yếu và thoái hóa đi. Vì vậy chỉ nên nhân cấy hai đến ba lần, nếu muốn có số lượng cây con nhiều hơn nữa thì phải lấy sinh mô mới để có thêm tiền củ hay mô sẹo mới

- Chỉ nên lấy sinh mô của những cây khỏe mạnh, không nhiễm bệnh đặc biệt là virus.

- Chỉ nên cấy những cây mà ta biết rõ đặc tính tốt của nó, không nên cấy mô từ những cây con gieo hạt khi chưa biết hoa của nó.

6. Một số môi trường nhân giống Mokara bằng phương pháp nuôi cấy in- vitro

w. Thành phần môi trường MS (Murashige – Skoog, 1962)

Đa lượng Nồng độ mg/L Vi lượng Nồng độ mg/L

KNO3 1900 MnSO4.4H2O 22.3 NH4NO3 1650 H3BO3 6.2 CaCl2.2H20 440 CoCl2.6H2O 0.025 MgSO4.7H2O 370 CuSO4.5H2O 0.025 KH2PO4 170 KI 0.83 Na2MoO4.2H2O 0.25 ZnSO4.7H2O 8.6 Vitamin - Pyridoxine (B6) 1 mg/l - Thiamine (B1) 1 mg/l - Nicotinic acid 1 mg/l

38 - m-Inositol 100 mg/l - Biotine 0.01 mg/l - D-pantothnic acid 1 mg/l * Fe EDTA - FeSO4.7H2O 27.8 mg/l - Na2EDTA.2H2O 37.3 mg/l

x. Môi trường vào mẫu phát hoa - MS đầy đủ - MS đầy đủ - BAP 2 mg/lít. - NAA 0,5 mg/lít. - Đường 20 g/lít. - Pepton 2 g/lít. - Agar 7 g/lít.

y. Môi trường nhân nhanh

- MS đầy đủ - Khoai tây 10 mg/lít. - Khoai tây 10 mg/lít. - Nước dừa (CW) 10%. - Đường 20 g/lít - NAA 5 mg/lít - Agar 7 g/lít

4. Chuyển cây ra vườn ươm

Giống cây nuôi cấy mô từ lúc đưa ra khỏi ống nghiệm trồng cho đến khi ra hoa chia thành 4 giai đoạn: Cây non, cây bánh tẻ, cây lớn và thúc ra hoa.

Quy trình

Tái sinh cây hoàn chỉnh

39 Trồng vào giá thể

Chăm sóc * Thuyết minh quy trình

- Khi mầm rễ đã phát triển tốt chuyển cây ra ngoài huấn luyện cho cây thích hợp với điều kiện tự nhiên. Sau khi huấn luyện cây tiến hành chuyển cây ra ngoài ngâm cây vào dung dịch nước sạch có pha 1/4 thìa cà phê N:P:K với tỷ lệ 1:1:1 chuyển ra giá thể gạch nung già và cho vào chậu.

- Khi cây con trong chậu có giá thể gạch nung 4 tháng chuyển sang chậu nhỏ, tách riêng lẻ nuôi trong chậu có đường kính 8 – 10 cm. Sau thời gian thấy cây đã lớn tiến hành chuyển chậu lớn cố định.

III. Kỹ thuật trồng và chăm sóc Lan Mokara

Mokara là một giống Lan có thời gian sinh trưởng khá chậm, kể cả giai đoạn nuôi cấy và ươm trồng cây con, thời gian trồng trong vườn cũng phải 24 tháng để cây ra hoa (trồng từ cây con) và ít nhất phải mất 6 tháng (đối với cành chiết hoặc cây >=20 cm), nhưng do hiệu quả kinh tế cao nên người đầu tư vườn Lan Mokara ngày càng nhiều và diện tich Mokara ngày càng phát triển

1. Kỹ thuật trồng:

b. Chuẩn bị nhà trồng Lan

 Hướng giàn Lan:

Hướng của giàn Lan rất quan trọng. Làm sao để lúc nào vườn cũng có ánh sáng và bóng râm. Hiện nay có lưới nilon màu đen có tác dụng tản nhiệt và hạn chế ánh sáng được bán rộng rãi nên rất thuận tiện, giàn Lan không cần phải theo hướng nữa mà tùy theo thế đất của mình làm giàn Lan thế nào cũng được.

 Sườn giàn Lan:

40 - Trụ đứng: Trụ phải được trồng bằng sắt hoặc bằng bê tông để đảm bảo lâu dài, có nhiều cây chằng ngang dọc để giữ vững. Cột trụ phải cao khoảng 3-3.5m. - Giàn che nắng: Dùng để che ánh sáng trực tiếp. Thường làm bằng lưới nilon, chỉ cần căng cho thật phẳng vài sợi dây thép là lợp lưới được.

Tương tự làm giàn Lan Dendrobium nhưng phải làm luống thay vì làm giàn treo và kệ.

 Luống trồng:

- Chiều dài của luống trồng Lan tuỳ thuộc vào diện tích đất. Tuy nhiên chiều dài luống không nên làm quá dài bất tiện cho việc đi lại chăm sóc.

- Chiều rộng luống có thể 0,7m hoặc 1,2m tùy theo bố trí trồng 2 hàng cây hay 4 hàng cây.

- Chiều cao của luống tính từ mặt đất là 30cm - Luống cách luống 0,6m để làm lối đi.

c. Chuẩn bị trồng

Chuẩn bị giá thể là vỏ đậu phộng: vỏ đậu phộng khi còn tươi thường dễ bóc nóng khi đổ đầy trên líp trồng. Để giảm nhiệt độ trong liếp vỏ đậu phộng thường phải để sau 7 – 10 ngày và thường xuyên tưới nước. Thọc tay vào thấy mát là có thể trồng được.

Cắt bỏ những rễ bị khô hoặc có vết trầy xước và phần gốc bị khô. Không nên trồng cây ngay khi mới nhận về. Trước hết cần ngâm thuốc trị nấm như Allietet hoặc Zineb hoặc Captan hoặc Metaxyl (Ridomil) trong 10 phút. Treo ngược riêng từng cây cho ráo nước thuốc trong vòng một ngày. Sau đó có thể trồng được.

d. Trồng vào luống

Trồng cách mặt vỏ đậu phọng từ 10 – 15 cm. Có các kiểu trồng như trồng hàng ngang và trồng dọc. Cây được giữ đứng bằng thanh tre cắm đứng và dây cáp căng dọc, buộc cây bằng dây điện nhỏ. Buộc các cây Lan vào các nẹp, cành này

41 cách cành kia khoảng 20 cm. Gốc cành Lan không chạm hay chôn vào đất. Các cành Lan dài khoảng 40 – 45 cm càng nhiều tầng rễ càng tốt, chúng thường có 2 – 3 tầng rễ.

Dùng gạch, chậu bể, gáo dừa, than,v.v..khoả lên mặt luống cho chạm đến

gốc Lan,

lớp trên cùng dùng sơ dừa đã ngâm ướt phủ lên nhưng không đè nén mà phủ nhẹ nhàng cho xốp, sắp xếp cho đều và đẹp mắt. Tính từ mặt đát lên đến xơ dừa cao khoảng 20cm, không phủ gốc Lan.

Trồng ngang Mokara Trồng Mokara trên lưới

42 2. Chăm sóc:

Che nắng cho Lan khi mới trồng bằng các phên tre hay các tàu lá dừa, hoặc lưới che để có khoảng 50 -60% ánh sáng. Gở bỏ dần giàn che khi cây đã phát triển tốt, đến khi có lá che chở cho nhau thì không cần sự che chắn gì cả. Duy trì độ ẩm cao thường, ngày dâm mát tưới một lần, ngày nắng tưới hai lần, tưới phun mù hay tưới nhỏ giọt, tạo môi trường thoáng mát thường xuyên. Sau khi trồng 3 ngày tiến hành phun thuốc dưỡng cây nồng độ 50 ml/8 lít để cây hồi sức mạnh lên và ra rễ mới. Phun dinh dưỡng cho Lan: 10 ngày phun một lần.

+ Đối với cây nhỏ phun N-P-K (30-10-10) liều lượng một muỗng canh cho 8 lítnước.

+ Đối với cây lớn phun N-P-K (20-20-20), liều lượng một muỗn canh cho 8 lít

+ Mỗi lần phun có thể thêm vitamin B1, ZnSO4, MgSO4, KCl, acid amine. Khi cây ra rễ đến lớp vỏ đậu phộng, có thể rải thêm phân hữu cơ.

Tưới nước: Vào mùa mưa không cần phải tưới đẫm, chỉ cần tưới mát trên cây nếu cảm thấy nhiệt độ hơi cao trong vườn Lan và tưới đẫm khi thấy bề mặt lớp vỏ đậu phộng bị khô trong những ngày không mưa. Vào mùa nắng tưới đẫm vào buổi sáng (9 giờ sáng) tưới nhẹ vào buổi chiều (sau 14 giờ).

3. Bón phân

Nếu bón phân vô cơ cho Lan: chủ yếu sử dụng phân khoáng kết hợp điều tiết sinh trưởng giai đoạn Lan con sử dụng N-P-K (30-10-10) phun 5 ngày/lần. Cây lớn thì sử dụng N-P-K kết hợp với vi lượng N-P-K (10-10-10) pha với nồng đọ 1/500 -1/300. Giai đoạn cây có hoa dùng N-P-K tỷ lệ (10-50-50) tiến hành phun 10 15 ngày/lần hoặc tưới dung dịch vào gốc pha 1/500 – 1/300, phun lên lá với nồng độ 1/1000 đến 2/1000.

Nếu bón phân hữu cơ cho Lan: bón phân bò ở gốc hoặc trét phân bò, phân heo lên các nẹp tre, thân Lan. Có thể chia ra các giai đoạn để tưới phân:

43

a. Một số loại phân thường dùng:

- Terra sorb - 4 dùng 2ml/lít nước

- NPK 30-10-10 hoặc NPK 30-15-10 dùng 1g/lít - Vitamin B1 dùng 1ml/lít

- Cách phun: Phun định kỳ 5 ngày/ lần.

b. Giai đoạn sinh trưởng:

Một số loại phân thường dùng: - Phân cá Fish Emulsion 1ml/lít nước - NPK 20-20-20 (1-1.5gam/lít)

- Vitamin B1 dùng 1ml/lít

- NPK 30-15-10 dùng 1g-1.5/lít Phun định kỳ 5 ngày/ lần.

- Phân Dynamic rải gốc 10g/gốc. Định kỳ rải gốc 1-1.5 tháng/lần. Rải phân khi rễ Mokara xuống nhiều và chạm với vỏ đậu .

c. Giai đoạn ra hoa

Một số loại phân thường dùng:

- Phân cá Fish Emulsion 1ml/lít nước - NPK 20-20-20 (1-1.5gam/lít)

- Vitamin B1 dùng 1ml/lít

- Phân Dynamic rải gốc 10g/gốc. Định kỳ rải gốc 1-1.5 tháng/lần - Rong biển 10g/30ml

Mặt khác ta cũng phải thường xuyên phòng ngừa bệnh cho cây. 4. Sâu bệnh

- Bệnh cháy lá vì dư ánh sáng. - Bệnh đốm vàng do mưa nhiều

- Bệnh thiếu các yếu tố đa vi lượng: Đạm, Lân, Kali, Magie, Canxi, Sắt, Bor, Mangan…

44 - Bệnh do rệp bông hay rệp sáp.

- Bệnh do bọ trĩ. - Bệnh do rệp vảy.

- Bệnh do vi khuẩn: Bệnh thối mềm do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra.

- Bệnh do nấm:

+ Bệnh thối đen: bệnh do 2 loại nấm Pythium sp. và Phytophthora sp. gây ra, gặp nhiều trên lá đang thối.

+ Bệnh đốm vàng: do nấm Colletotrichum sp gây ra. + Bệnh khô cháy lá: do nấm thuộc giống Phylostica. + Bệnh đốm nâu: do nấm Phllostictina piriformis gây ra.

+ Bệnh đốm lá: do nấm Cercospora sp. có bào tử màu nâu đen. Sử dụng các loại thuốc trừ nấm như Zineb 3/2000, Benlat 1/2000.

+ Bệnh đốm vòng cánh hoa: do nấm Alternaria sp. gây ra. Có thể sử dụng thuốc trừ

nấm phổ rộng như Daconil 500 SC.

+ Bệnh héo rễ: do nấm Sclerotium rolfsii làm cho rễ khô dần

- Bệnh do động vật, côn trùng: các động vật cắn phá trực tiếp Lan, chúng ăn đọt non, chồi mới, nụ hoa, đầu rễ, cắn nhụy, hút nhựa…làm cho cây không phát triển được.

Thực hiện phun phòng định kỳ 10-15 ngày /lần. Sử dụng luân phiên các loại thuốc khác nhau:

Thuốc trừ bệnh thường dùng là Rhidomil, Aliette, Score, Vicarben Thuốc sâu: Decis, Bassa, B thái Lan…

5. Điều kiện trồng:

45 Nhiệt độ tác động đến cây Lan qua con đường quang tổng hợp. Cường độ quang hợp tăng theo nhiệt độ: thường khi nhiệt độ tăng 10oC thì tốc độ quang hợp tăng lên gấp hai lần. Do vậy khi nhiệt độ tăng cao, nhu cầu dinh dưỡng ở cây tăng. Vào mùa nắng, ta tăng cướng phân bón cho Lan để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng gia tăng này.

Tuy nhiên, nếu nhiệt độ thấm vào cây mà không tỏa được thì diệp lục tố sẽ bị tiêu hủy, lá ngã vàng và phản ứng quang hợp bị đình chỉ; ngoài ra nguyên sinh chất trong tế bào cũng bị đặc quánh lại do mất nước; hậu quả là cây ngừng hô hấp và chết đi. Trong trường hợp ngược lại khi nhiệt độ quá thấp, sẽ làm cho nước trong tế bào của cây kết tinh thành nước đá, làm gia tăng thể tích phá vỡ cấu trúc tế bào.

Mokara thuộc nhóm Lan ưa nóng. Nhiệt độ thích hợp ban ngày không dưới 21C. Nhiệt độ ban đêm không dưới 18.5C.

b. Ánh sáng:

Mokara là một trong những loại Lan có khả năng chịu nắng tốt nhất, ánh sáng yếu cường độ quang hợp giảm khi đó cây thiếu dinh dưỡng và không ra hoa. Cây trưởng thành có thể chịu đựng được từ 70-100% nắng tùy giống, tuy nhiên đối với cây con khả năng có thể chịu được tối đa 50% nắng. Phản ứng với ánh sáng của các giống Mokara là khác nhau nên cần tùy thuộc vào thực tế để điều chỉnh ánh sáng phù hợp.

Đặt Lan ở một vị trí có ánh sáng mặt trời buổi sáng cho đến trưa sẽ được đầy đủ nhất về ánh sáng. Mặc dù Mokara có thể chịu được cường độ cao ánh nắng mặt trời nhưng tránh cho tiếp xúc trực tiếp có thể gây cháy lá.

c. Tưới nước:

Tưới theo mùa. Do Mokara cần độ ẩm cao nên mùa khô tăng cường tưới