II. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in – vitro
1. Cơ sở khoa học nuôi cấy tế bào thực vật:
HaberLandt 1902, lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của mỗi cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân
25 hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó.
Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh đó là tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năng của tế bào mà HaberLandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh.
Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử liên tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô cơ quan có chắc năng khác nhau. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào khác nhau.
Quá trình phân hóa tế bào có biểu thị tuy nhiên khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng lại có thể về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình tuyệt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo chương trình đã được mã hóa cấu trúc của phân tử DNA cảu mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác tế bào nằm trong khối mô của cơ thể luôn bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào. Quá trình phát sinh hình
26 thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát triển hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toán của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát triển hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là Auxin và Cytokinin.
h. Auxin trong cây trồng
Tất cả cây trồng đều tổng hợp được chất Auxin dạng tổng hợp tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Chất Auxin sinh ra được hiện diện trong các lá rất non, trong các chồi đang hoạt động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quả còn non.
Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới cơ quan với một sự phân cực rõ ràng được thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhưng trong quá trình chuyển này chúng bị thoái hóa bởi sự Auxin-oxydase, điều này cho thấy nồng độ Auxin thì luôn cao hơn gần với nơi tổng hợp chúng. Như vậy, Auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở các mức điểm tăng trưởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào.
*Các chất Auxin tổng hợp - Acid indolybutyrique (AIB)
- Acid naphtylacetique (ANA) hoặc các chất dẫn xuất của chúng như: + Acid naphtyloxyacetique (ANOA)
+ Acid naphtylacetamide (NAD)
+ Acid 2,4 dichrolophen-oxyacetique (2,4D)
Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, những chất giống được sử dụng và Auxin đã chiếm một vị trí quan trọng hơn, hai tính chất của chúng được nghiên cứu thuộc lĩnh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ. Ngoài ra, trong thực tiễn chúng còn được dùng để giâm cành, để làm sáng quả, sự đậu quả và làm chậm sự thu hoạch quả.
27
i. Cytokinin
Cytokinin được khám phá do trung gian của sự nuối cấy in-vitro. Người ta đã biết sự thêm nước dừa vào môi trường nuôi cấy gây ra hiệu quả làm thuận lợi cho việc nhân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi. Vào năm 1956, Skoog đã cô lập được một chất rất hoạt động người ta đặt tên là kinetine, do DNA biến chất.
Cytokinin là các chất adenine (IPA). Cytokinin tự nhiên và các chất tổng hợp, có hai loại được sử dụng nhiều nhất là:
*Tính chất sinh lý của Cytokinin
- Tác động hiệu quả rõ lên sự phân chia tế bào, trong quá trình này, chúng cần thiết nhưng chúng không hiệu quả nếu vắng mặt Auxin, Cytokinin là chất bổ sung; Auxin làm thuận lợi cho sự nhân đôi của acid desoxyribonucleique.
- Có vai trò rất rõ trong việc tạo tế bào cơ quan thực vật, ở đây chúng sẽ kích thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non. Trái lại, chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ.
- Hoạt động kích thích trên sự chuyển hóa, làm thuận lợi một phần việc tổng hợp protein, mặt khác trong lúc bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động enzyme ly giải.
- Hiệu quả đối kháng của tính ưu thế chồi non: các chối nách được xử lý Cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi tận cùng.
- C có vai trò quan trọng trong nuôi cấy in-vitro, nó thể hiện các tính chất cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hóa.
* Cytokinin trong cây trồng
Được tìm thấy đầu tiên vào năm 1963 trong các phôi còn non của cây ngô (là zeatine); chất thứ hai là IPA thấy trong cây bị nhiễm vi khuẩn
28 Corymebacterium fascines. Chúng định vị ở lá non trong chồi và các đầu của rễ cây.
2. Các yếu tố môi trường cấy ảnh hưởng đến các giai đoạn trong nuôi cấy in-vitro: in-vitro:
Trong giai đoạn nuôi cấy in-vitro sự tăng trưởng của cây lớn được xác định bới các thành phần của môi trường nuôi cấy. Thành phần chính của hầu hết môi trường nuôi cấy mô là các thành phần khoáng, đường được xem là nguốn cung cấp carbon và nước. Những thành phần khác có thể được bổ sung bao gồm các chất hữu cơ, các chất điều hòa sinh trưởng, chất làm đặc môi trường. Mặc dù các thành phần khác nhau trong môi trường thay đổi theo giai đoạn nuôi cấy, môi trường MS (Murashige and Skoog) hầu hết được sử dụng phổ biến nhất.
j. Khoáng đa vi lượng
Các khoáng cung cấp cho cây trong môi trường nuôi cấy mô đều ở dạng các muối vô cơ, cây Lan có thể thích nghi phổ rộng các hỗn hợp muối vô cơ.
Đạm là thành phần của acid nucleic đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất, là thành phần chủ yếu của chất nguyên sinh của tế bào, do đó có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cây. Đạm được sử dụng trong nuôi cấy mô thường ở dạng muối (NH4+) và nitrat (NO3-).
Lân tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và tham gia vào cấu trúc của màng. Lân thường được sử dụng ở 2 dạng ion là H2PO4- và H2PO42-.
Nồng độ khoáng đa lượng và vi lượng trong môi trường ra rễ thường giảm xuống còn một nửa so với bình thường. Nguyên nhân có lẽ là do nhu cầu về đạm trong giai đoạn này giảm xuống.
k. Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong môi trường nuôi cấy mô là:
29 Thiamine HCl (vitamin B1); Pyridoxine HCl (vitamin B6); Acid nicotinic; Myo- inositol.
l. Nguồn sắt
Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelate kết hợp với Na2- Ethylen Diamin Tetra Acetat (EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng dần ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật.
m. Nguồn Carbon
Các nguồn carbon (sucrose; glucose) là một thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy mô. Các lĩnh vực vi nhân giống cho rằng sự hiện diện của đường trong môi trường cấy là quan trọng vừa cho sự phát triển rễ và nhân chồi, vừa làm tăng chiều cao của cây con. Nồng độ sucrose (20g/l và 30g/l) thường được sử dụng phổ biến nhất trong lĩnh vực nuôi cấy mô Lan. Sucrose thông thường được thêm vào môi trường để đẩy mạnh tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con. Sự vắng mặt của đường làm giảm những vấn đề về nhiễm môi trường cấy và cho phép các cây tăng trưởng một cách tự dưỡng trong điều kiện in-vitro khi nồng độ CO2 và mật độ ánh sang tăng.
n. Các chất hữu cơ
Nước dừa (CW-coconut) được dùng thong dụng trong nuôi cấy mô. Nước dừa cung cấp bổ sung cho môi trường các loại đường, amino acid, chất sinh trưởng và các chất trao đổi khác. Nước dừa chỉ kích thích những tế bào hay mầm còn non chưa trưởng thành và sự phát triển phôi, nước dừa thường dùng ở nồng độ 15%. Từ việc sử dụng nước dừa, nhiều mô thực vật được nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển như cây chà là, chuối, mầm lúa mì…Nhưng thông thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc.
30 Than hoạt tính có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định. Nó có tác dụng hấp thu các chất hữu cơ ngoại trừ đường. Sự kết hợp của 0.3% than hoạt tính trong môi trường đã được tìm thấy là có lợi cho sự tăng trưởng cả chồi. Ngoài ra việc boorsung than hoạt tính vào môi trường còn góp phần làm tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con.
3. Các bước nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in – vitro Phương pháp này trải qua các bước sau: Phương pháp này trải qua các bước sau:
- Tạo thể nhân giống in – vitro
- Nhân giống in – vitro
- Tái sinh cây hoàn chỉnh in – vitro
- Chuyển cây in – vitro ra vườn ươm
p. Tạo thể nhân giống in – vitro
Mẫu được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc. Có hai thể nhân giống in – vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể chồi nhân giống in – vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường sử dụng phương pháp nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác.
q. Nhân giống in – vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm mục đích tăng sinh khối về thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể tiền chồi, đôi khi nồng độ chất kích thích sinh trưởng được giảm thấp nhằm phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài.
Phải đảm bảo điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh nhanh. Cây nhân giống in – vitro được trẻ hoá và được duy trì trong thời gian dài.
31 Môi trường nhân giống thường là môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ sung các chất điều hoà tăng trưởng (auxin, cytokinin,…) với tỷ lệ phù hợp tùy loài nhằm tạo điều kiện cho quá trình nhân chồi.
Nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng nên giảm dần trong các lần cấy chuyền sau đó. Các chất chiết trái cây cũng được đề nghị dùng như nước cốt cà chua, nước dừa, nước chuối, nước khoai tây nhưng chúng chỉ có hiệu quả trong các lần cấy chuyền và thể tích cũng không quá 10% thể tích môi trường. Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan là 22C - 26C và tuỳ vào mỗi loài.
Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn gọi là thể chồi. Thể chồi được lấy ra khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6 miếng tuỳ kích thước của chồi. Lát cắt được chuyển vào môi trường duy trì (môi trường phát triển chồi). Mỗi đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển ra một thể chồi mới sau khoảng 4 tuần, có thể cắt tiếp và cấy chuyền sang môi trường mới.
r. Tái sinh cây hoàn chỉnh in – vitro
Đây là giai đoạn tạo ra cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khoẻ mạnh nhằm nâng cao sức sống khi được chuyển ra môi trường tự nhiên. Ở giai đoạn này các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích tạo rễ với điều kiện nuôi cấy tương tự như điều kiện tự nhiên. Đây là bước chuẩn bị trước khi cây được tách ra khỏi điều kiện in-vitro. Các chất auxin thường được dùng để kích thích ra rễ.
Khi đạt đến số cây giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi trường có lượng auxin tăng lên để kích thích ra rễ). Sau 4 - 5 tháng, các thể chồi sẽ phát triển thành cây con.
32 - Auxin: thường dùng ở nồng độ 0,01 mg/l – 10 mg/l, có tác dụng trong sự phân cắt tế bào, tạo rễ bất định, ức chế sự tạo chồi, giúp sự phát khởi và sinh trưởng của mô sẹo, cảm ứng sự tượng phôi sinh dưỡng.
- Cytokinin: thường dùng ở nồng độ 0,1mg/l – 10 mg/l giúp sự phân cắt tế bào, kích thích sự tạo chồi, ức chế sự tạo rễ.
Auxin và cytokinin thường được pha thành dung dịch mẫu có nồng độ 1 mg/l, chúng hoà tan trong NaOH và lưu trữ lạnh ở 0 – 5C.
s. Chuyển cây in – vitro ra vườn ươm
Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in – vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm…do đó khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp nên cây con dễ bị streess, dễ mất nước và mau héo. Để khắc phục tình trạng trên ta phải thiết kế vườn ươm thích hợp với cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí thích hợp, độ ẩm cao…Cây con thường được trồng trong luống ươm cây có giá thể dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm. Trong những ngày đầu cần được phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường 7 – 10 ngày kể từ ngày trồng). Rễ cây tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ lần lần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện.
4. Thuận lợi và khó khăn trong nhân giống invitro
a. So sánh với phương pháp nhân giống thông thường thì những phương pháp invitro có những thuận lợi: phương pháp invitro có những thuận lợi:
- Cây nhân giống invitro đồng nhất về di truyền.
- Được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, cây khỏe mạnh, sạch bệnh thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
- Có thể sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…
33 - Sản xuất được số lượng lớn cây giống với một diện tích nhỏ trong một thời gian ngắn nhằm đáp ứng kịp thời nhu cầu của những người trồng thương mại.
- Giúp bảo quản nguồn giống cây in-vitro với số lượng lớn nhưng lại chiếm diện tích nhỏ.
b. Bên cạnh những thuận lợi, phương pháp nhân giống in-vitro vẫn còn có một số khó khăn như: