Các thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu được xác định theo các phương pháp tiêu chuẩn về phân tích thành phần hóa học gỗ và nguyên liệu thực vật [1].
2.2.1.1. Xác định độ ẩm nguyên vật liệu
Gỗ và các thành phần tách từ nó là các chất dễ hút ẩm, ở dạng khô gió chúng chứa một lượng hơi nước nhất định, cân bằng với độ ẩm của không khí. Khi phân tích gỗ cần xác định độ ẩm (độ ẩm tương đối) của mẫu, tiến hành song song ít nhất hai lần và tính hệ số khô K của mẫu. Hệ số này biểu thị hàm lượng của gỗ khô tuyệt đối trong mẫu. Sự chính xác của tất cả các phân tích hóa học phụ thuộc vào việc xác định độ ẩm.
Để xác định độ ẩm, người ta sử dụng các phương pháp khác nhau, như phương pháp sấy khô, phương pháp chứng cất nước với các dung môi không phân cực, chuẩn độ nước bằng hóa chất Fisher,… Phổ biến và đơn giản nhất là phương pháp sấy khô.
Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy thường được tiến hành với mẫu gỗ khoảng từ 1g trở lên, trong chén cân bằng thủy tinh hoặc bằng nhôm, tới trọng lượng không đổi, ở nhiệt độ 100-105oC. Sấy ở nhiệt độ thấp hơn 100oC có thể nước không bay hơi hết, còn ở nhiệt độ cao hơn 105oC một số thành phần của gỗ có thể bị phân hủy, dẫn đến mất mát khi phân tích. Tuy nhiên, một số tiêu chuẩn hiện hành (như TAPPI) lại cho phép sấy ở nhiệt độ cao hơn (105±3).
Độ ẩm nguyên liệu, các sản phẩm trung gian và sản phẩm phân tích được xác định theo tiêu chuẩn TAPPI T207 cm-99.
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Nguyễn Thị Phương Thảo – Lớp KTHH2014B
33
W = . 100%;
Trong đó: m - khối lượng chén cân (g);
m1 - khối lượng chén cân và vật liệu trước khi sấy (g); m2 - khối lượng chén cân và vật liệu sau khi sấy (g).
Sai số giữa kết quả của hai lần xác định song song không vượt quá 0,5%. Hệ số khô của vật liệu được tính theo biểu thức sau:
K = ;
Độ khô của mẫu vật liệu (%) = 100K.
2.2.1.2. Xác định hàm lượng xenlulozơ theo phương pháp Kurshner
Để xác định hàm lượng xenluloza trong gỗ và nguyên liệu thực vật khác, người ta sử dụng các tính chất khác biệt của xenluloza, so với các chất khác trong gỗ. Chẳng hạn, khác với các chất trích ly, xenluloza không tan trong nước và các dung môi hữu cơ. Khác với lignin, xenluloza tương đối bền dưới tác dụng của các chất oxi hóa, nó bị thủy phân dưới tác dụng của các axit, còn khác với hemixenluloza, nó không bị tan trong dung dịch kiềm loãng và khó bị thủy phân hơn.
Phương pháp sử dụng dung dịch axit nitơric trong etanol, hay gọi là phương pháp Kurshner, sử dụng dung dịch etanol của axit nitơric làm tác nhân xử lý gỗ. Lignin bị nitrat hóa và bị oxi hóa phân hủy. Các sản phẩm phản ứng tan trong etanol. Hemixenluloza bị thủy phân (khoảng 65-75%). So với trong nước, sự phân hủy xenluloza dưới tác dụng của axit nitơric diễn ra ít hơn. Tuy nhiên, bậc trùng hợp của xenluloza giảm do chịu tác dụng của etanol và một phần xenluloza bị vô định hình hóa. Trong phương pháp này, không cần phải tiến hành trích ly gỗ trước bằng dung môi hữu cơ, do các chất trích ly sẽ bị hòa tan trong etanol [4].
Hàm lượng xenlulozơ (%) so với nguyên liệu khô tuyệt đối được tính theo công
thức sau: X = ; m m m m 1 2 1 m m m m W 1 2 100 100 100 ) ( 1 g m m
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Nguyễn Thị Phương Thảo – Lớp KTHH2014B
34
Trong đó: m1- khối lượng của xenlulozơ và phễu lọc (giấy lọc+chén cân) (g); m - khối lượng phễu lọc (giấy lọc+chén cân) (g);
g- khối lượng nguyên liệu khô tuyệt đối (g);
Sai số giữa kết quả của hai lần xác định song song không vượt quá 0,05%.
2.2.1.3. Xác định hàm lượng lignin trong gỗ theo phương pháp thủy phân bằng axit sulfuric của Komarov
Hàm lượng lignin trong gỗ và nguyên liệu thực vật nói chung, được xác định bằng các phương pháp trực tiếp. Chúng dựa trên phương pháp thu lignin từ nguyên liệu bằng cách tách loại các thành phần còn lại: chất trích ly được trích ly bằng các dung môi hữu cơ, polisaccarit – thủy phân bằng các axit vô cơ nồng độ cao.
Trên phương diện phân tích, lignin được hiểu là phần nguyên liệu thực vật còn lại dưới dạng bột không tan, sau khi nguyên liệu đã được xử lý nhựa và thủy phân bằng axit vô cơ. Như đã biết, các axit vô cơ nồng độ cao có khả năng biến đổi lignin, nhờ phản ứng thủy phân các liên kết ete và phản ứng ngưng kết, song mẫu lignin được phân lập có khối lượng tương đối tương ứng với hàm lượng của nó trong gỗ. Lượng chất này cộng với lượng các chất trích ly, cũng tương ứng với lượng các chất bị tách bỏ khi xác định hàm lượng holoxenluloza. Chính vì vậy, phương pháp sử dụng tác nhân axit để xác định lignin, đến nay vẫn được xem là phương pháp đáng tin cậy nhất.
Hàm lượng lignin (% so với gỗ khô tuyệt đối), bỏ qua độ tro, được tính theo công thức sau:
L = ;
Trong đó: m1 - khối lượng của phễu lọc (hoặc giấy lọc) và lignin (g); m - khối lượng phễu lọc (giấy lọc) (g);
g - khối lượng bột gỗ khô tuyệt đối (g); K - hệ số trích ly
Sai số giữa kết quả của hai lần xác định song song không được vượt quá 0,05% .
100
1 K
g m m
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Nguyễn Thị Phương Thảo – Lớp KTHH2014B
35
2.2.1.4. Xác định hàm lượng pentozan trong gỗ bằng phương pháp Bromua- Bromat biến tính
Hàm lượng pentozan trong gỗ và các dạng nguyên liệu thực vật khác được xác định bằng các phương pháp gián tiếp. Hàm lượng từng loại pentozan (tính theo xylan và arabinan) được xác định bằng cách thủy phân pentozan thành pentoza, rồi phân tích hàm lượng đường đơn thu được bằng phương pháp sắc ký. Hàm lượng chung của tất cả các pentozan trong gỗ được xác định bằng cách biến đổi chúng thành furfurol, rồi xác định furfurol theo các phương pháp khác nhau. Sau đó chuyển đổi sang hàm lượng pentozan.
Là phương pháp chuẩn độ phổ biến nhất. Phương pháp này dựa trên việc xác định tiêu hao brom cho phản ứng với furfurol khi xử lý dịch chưng cất chứa furfurol, bằng dung dịch hai muối bromua-bromat.
Trong môi trường axit brom thu được từ phản ứng:
5KBr + KBrO3 + 6HCl 3Br2 + 6KCl + 3H2O
Brom tác dụng với furfurol, còn lượng dư brom được xác định bằng cách chuẩn độ bởi iốt, tức bổ sung kali iodua vào dung dịch và chuẩn lượng iốt tạo thành bằng dung dịch tiosulfat natri. Phản ứng diễn ra theo phương trình sau;
Br2 + 2KI I2 + 2KBr I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6
Căn cứ vào lượng brom tiêu hao tính ra hàm lượng của furfurol trong dịch chưng cất, hiệu chỉnh bằng các hệ số thực nghiệm để tính lượng pentozan trong gỗ.
2.2.1.5. Xác định hàm lượng các chất tan trong nước nóng
Các chất tan trong nước có thể chia thành các chất cao phân tử và các chất có phân tử lượng thấp. Các hợp chất cao phân tử bao gồm các polisaccarit (như tinh bột, arabinangalactan), các chất pectin, nhựa cây, protein,… Các chất có phân tử lượng thấp bao gồm tanin, các chất nhuộm, rượu mạch vòng, monosaccarit, các muối tan trong nước,… Một số chất tan trong nước, có thể tan một phần trong các
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Nguyễn Thị Phương Thảo – Lớp KTHH2014B
36
dung môi hữu cơ, còn một phần các chất tan trong dung môi hữu cơ lại có thể tan trong nước.
Thông thường người ta xác định tổng hàm lượng các chất tan trong nước lạnh hoặc nước nóng (gần 100oC). Đôi khi lại xử lý bột gỗ lần lượt bằng nước lạnh và nước nóng. Lượng các chất tan trong nước được xác định, hoặc theo sự giảm khối lượng của gỗ khô tuyệt đối, hoặc theo khối lượng của chất khô còn lại, sau khi chưng bốc nước.
Ngoài các chất mà nước lạnh hòa tan được, nước nóng còn có thể trích ly được các chất pectin tan trong nước và các polisaccarit (như tinh bột, arabinangalactan).
Hàm lượng các chất tan trong nước nóng được tính theo công thức sau:
E = ,
Trong đó:
g - khối lượng bột gỗ khô tuyệt đối (g);
m1- khối lượng phễu lọc (chén cân+giấy lọc) và nguyên liệu sau khi sấy (g); m- khối lượng phễu lọc (chén cân+giấy lọc) (g);
Sai số giữa kết quả của hai lần xác định song song không vượt quá 0,05% .
2.2.1.6. Xác định hàm lượng các chất tan trong nước lạnh
Dịch trích ly bằng nước nóng thường chứa nhiều polisaccarit hơn, so với dịch trích ly bằng nước lạnh.
Hàm lượng các chất tan trong nước lạnh được tính theo công thức sau:
E = ,
Trong đó: g - khối lượng bột gỗ khô tuyệt đối (g);
m1 - khối lượng phễu lọc (chén cân+giấy lọc) và bột gỗ sau sấy (g); m- khối lượng phễu lọc (chén cân+giấy lọc) (g);
Sai số giữa kết quả của hai lần xác định song song không được vượt quá 0,05%.
100 ) ( 1 g m m g 100 ) ( 1 g m m g
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Nguyễn Thị Phương Thảo – Lớp KTHH2014B
37
2.2.1.7. Xác định độ tro bằng phương pháp đốt
Về nguyên tắc, hàm lượng các chất vô cơ trong gỗ tương đối thấp. Đối với các loài cây ôn đới là 0,1-1,0%, còn đối với cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng có thể đạt 5-8%. Lượng và thành phần của chúng tùy thuộc vào loại gỗ, điều kiện sinh trưởng, lập địa của cây, thời gian khai thác,… Các hợp chất vô cơ khi đốt sẽ tạo thành tro. Lượng tro đặc trưng cho hàm lượng các chất vô cơ, song về giá trị không bằng hàm lượng thực của chúng, do khi đốt cháy gỗ, một số chất vô cơ biến đổi thành oxit hay muối cacbonic hoặc có thể bị mất mát, do một số muối clorua và amoni có thể bay hơi. Thành phần của tro được xác định bằng các phương pháp phân tích hóa học (như sử dụng các phương pháp cân, chuẩn độ, so mầu hay phương pháp tạo phức chất), đồng thời sử dụng các phương pháp hóa lý, như phổ học phát xạ, phổ học hấp thụ nguyên tử, phương pháp kích hoạt nowtron, …).
Hàm lượng tro (%) so với nguyên liệu khô tuyệt đối được tính theo công thức: ;
Trong đó: m1 - khối lượng chén nung có tro (g); m - khối lượng chén nung không tro (g); g - khối lượng bột gỗ khô tuyệt đối (g).
Sai số giữa kết quả của hai lần xác định song song không vượt quá 0,05% .
2.2.1.8. Xác định hàm lượng các chất tan trong dung dịch NaOH 1%
Cân hai mẫu nguyên liệu khô gió tương đương 2±0,1 g và tiến hành song song. Cho nguyên liệu vào bình tam giác 250 ml và bổ sung 100 ml dung dịch NaOH 1±0,1%. Sau khi lắc nhẹ, đặt bình lên bếp cách thủy đang sôi. Đậy bình bằng nắp thủy tinh và đun sôi hỗn hợp trong vòng 1 giờ, sau 10, 15 và 25 phút khuấy trộn đều một lần. Sau đó lọc hỗn hợp bằng phễu thủy tinh xốp, rửa phần nguyên liệu không tan còn lại bằng nước cất nóng (khoảng 100 ml). Tiếp đó xử lý hai lần bằng 25 ml dung dịch axit axetic 10% trong vòng 1-2 phút, lọc lấy bột nguyên liệu, lại rửa sạch
100 1 g m m A
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Nguyễn Thị Phương Thảo – Lớp KTHH2014B
38
bột bằng nước cất nóng (tới phản ứng trung tính với metyl da cam), sấy ở 105 3oC tới khối lượng không đổi.
Hàm lượng các chất tan trong dung dịch NaOH 1% (% so với nguyên liệu khô tuyệt đối) được tính theo công thức:
E = ;
Trong đó: m1 - khối lượng phễu lọc (chén cân+giấy lọc) và nguyên liệu sau xử lý (g) m - khối lượng phễu lọc (chén cân+giấy lọc) (g)
g - khối lượng nguyên liệu khô tuyệt đối (g)
Sai lệch giữa các lần xác định song song không vượt quá 0,5%.
2.2.1.9. Phương pháp xác định hàm lượng các chất trích ly
Cân một lượng bột gỗ khô gió tương đương 2,0±0,1 g bột khô tuyệt đối chính xác tới 0,1 mg. Cân hai mẫu để tiến hành song song. Gói cẩn thận bằng giấy lọc thành 1 gói hình trụ, buộc chặt hai đầu bằng sợi chỉ trắng, sao cho đường kính của hình trụ nhỏ hơn đường kính trong của ống trích ly (để có thể đặt vào và lấy ra dễ dàng), còn chiều dài điều chỉnh sao cho khi đặt vào ống trích ly, đầu trên của nó phải cách mức trên của ống xifon khoảng 1,5 cm. Rót vào bình cầu dung tích 250 ml khoảng 200 ml dung môi.
Lắp bộ trích ly theo sơ đồ và đặt vào bể cách thủy. Nhiệt độ của bể được điều chỉnh bằng nhiệt độ sôi của dung môi. Để điều chỉnh lượng dung môi hợp lý, đơn giản cho công đoạn chưng bốc dung môi sau đó, thường nó được rót vào bình qua sinh hàn rồi vào ống trích ly, sao cho lượng dung môi đủ cho 2-3 lần tự rót từ ống trích ly sang bình.
Quá trình trích ly kéo dài trong vòng 5-6 giờ kể từ khi dung môi bắt đầu tự rót từ ống xifon xuống bình chưng. Điều chỉnh nhiệt độ của bếp sao cho cứ 10 phút dung môi lại tự rót 1 lần từ ống trích ly sang bình qua ống xifon, hay khoảng 30-35 lần rót. 100 ) ( 1 g m m g
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Nguyễn Thị Phương Thảo – Lớp KTHH2014B
39
Sau đó ngừng gia nhiệt, bổ sung một ít nước lạnh vào bể đun để tránh dung môi tiếp tục bay hơi và tháo dỡ bộ trích ly. Sấy dung dịch các chất trích ly bằng Na2SO4 khan để loại nước (cho vài thìa nhỏ Na2SO4 khan vào bình chứa dung dịch các chất trích ly và để qua đêm).
Sau đó, dùng phễu lọc để lọc và chuyển dung dịch các chất trích ly đã sấy sang một bình cầu nhỏ loại 100 ml đã sấy khô tới khối lượng không đổi, tráng bình bằng dung môi nguyên chất, chưng cất dung môi trên bộ cất quay chân không ở 60oC, rồi sấy chân không trong bình hút ẩm chân không với chất hút ẩm là CaCl2 và một ít NaOH khan tới khối lượng không đổi, sau đó cân để xác định khối lượng.
Hàm lượng các chất trích ly (E %) so với nguyên liệu khô tuyệt đối, được tính theo công thức:
E =
Trong đó: m1 - khối lượng bình chứa các chất trích ly (g);
m - khối lượng bình không (g);
g- khối lượng mẫu bột gỗ khô tuyệt đối (g);
Sai số giữa kết quả của hai lần xác định song song không vượt quá 0,05%. Hệ số trích ly K được tính theo công thức: K= (100 - E) / 100
Hàm lượng các chất trích ly là kết quả trung bình cộng hai mẫu xác định song song.
Chiết phân bố sang ete etylic
Cho dung dịch dietyl ete vào bình chứa và lắc đều cho tan các vết nhựa. Sau đó xử lý dung dịch bằng dung dịch NaHCO
3 bão hòa, hỗn hợp phân thành 2 lớp (phần dưới là axit, phần trên là các hợp chất trung tính) theo hình 2.1.
Xử lý phần dưới bằng dung dịch H
2SO
410% đến pH 1-2, sau đó tách chiết dung dịch bằng dietyl ete, thu được phần dịch tan trong dietyl ete. Tiến hành cất quay chân không để thu hồi dung môi dietyl ete, sau đó sấy chân không và xác định khối lượng. Trước đi đem đi đo phổ GC - MS, các chất nhựa trong bình được hòa tan trong cồn tuyệt đối.
100 ) ( 1 g m m
Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật Nguyễn Thị Phương Thảo – Lớp KTHH2014B
40
Xử lý phần trên bằng dung dịch NaOH 2% đến pH 1-2, sau đó tách chiết bằng dietyl ete và xử lý tiếp theo các công đoạn trên và tiến hành đo phổ GC - MS.
Hình 2.1. Sơ đồ chiết phân bố sang ete etylic
2.2.2. Phƣơng pháp xử lý dăm mảnh gỗ với chế phẩm sinh học
Chuẩn bị dung dịch chế phẩm sinh học
Chế phẩm sinh học Cartapip 97 được bảo quản theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Hoạt lực được phân tích tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các mức dùng chế phẩm trong thí nghiệm sẽ tính theo hoạt lực được xác định và được lựa chọn tùy theo mục tiêu của từng thực nghiệm.