Đầu tiờn Michelangelo Anastassiades [32] đề xuất quy trỡnh QuEChES như
sau :
- Giai đoạn xử lý mẫu : Mẫu nụng sản ban đầu (cỏch lấy mẫu tựy thuộc vào
đối tượng và theo hướng dẫn phũng thớ nghiệm hoặc theo quy định quản lý cấp cao hơn ) được xử lý sơ bộ như : loại bỏ phần đất, sỏi ... khụng liờn quan. Sau đú mẫu
được nghiền nhỏ, mịn ( lý tưởng là được nghiền trạng thỏi đụng lạnh) để giảm tối đa sự khỏc biệt trong một mẫu và tăng tối đa bề mặt tiếp xỳc cho quỏ trỡnh chiết. Với những mẫu thụ như hoa quả thỡ được cắt ở kớch cỡ < 3x3 cm sau đú mới đem đồng nhất mẫu. Sau khi đồng nhất mẫu được cõn một lượng phự hợp để phõn tớch ngay hoặc bảo quản nhiệt độ < - 20oC.
- Cõn 10 – 15 gam/mẫu vào ống tuyp ly tõm loại 50ml cú nắp kớn. Với mẫu cú hàm lượng nước thấp như chố, gạo, ngũ cốc thỡ cần thờm nước vào để hàm lượng nước > 75% để trong 2 h.
- Thờm 10 ml axetonitril (ACN) rung lắc mạnh khoảng 2 – 3 phỳt. Sau đú thờm MgSO4, NaCI, hỗn hợp muối đệm xitrat Na3C6H5O7và Na2C6H6O7 sao cho pH mẫu đạt 5 -5,5 [32].
- Rung lắc mạnh 2-3 phỳt và ly tõm 3000vũng/phỳt trong 5 phỳt để pha hữu cơđược phõn tỏch. Thu pha hữu cơ và thờm cỏc chất hấp phụ amin như PSA, than hoạt tớnh (GCB) để làm sạch loại bỏ cơ chất thực vật, chất diệp lục. Tiến hành ly tõm lần nữa, thu lấy pha hữu cơđem thổi khụ bằng khớ N2 . Tựy thuộc thiết bị phõn tớch là hệ GC-MS/FPD/àECD hay HPLC-MS/MS mà định mức bằng dung mụi thớch hợp [32].
Hiện nay để thuận tiện trong chiết tỏch người ta đúng gúi sẵn hỗn hợp muối vụ cơ, muối đệm, chất làm sạch (PSA, GCB ) thành những bộ kit (dạng dung dịch hoặc dạng bột rất mịn ). Hiển nhiờn tựy theo đối tượng nụng sản và hoạt chất pesticide quan tõm mà thành phần mỗi bộ kit là khỏc nhau. Chớnh vỡ cú nhiều hoạt
chất và nhiều loại nụng sản khỏc nhau mà hiện nay tồn tại nhiều quy trỡnh khỏc nhau.
1.3.2. Phương phỏp QuEChERS – AOAC 2007-01
Áp dụng được cho cỏc thuốc trừ sõu dưới đõy trờn đối tượng nho, rau diếp, và cam: Atrazine, azoxytrobin, bifenthrin, carbaryl, chlorothalonil, chlorpyrifos, chlorpyrifos-methyl, lambda-cyhalothrin (trong rau diếp), cyprodinil, o-p’-DDD, dichlorvos, endosulfan-sulfat, ethion ( trong cam), imazalil, imidacloprid, kresoxim- methyl ( trong nho) , linuon, methamidophos, methomyl, permethrins ( trong dau diếp) procymidone, pymetrozine, tebuconazole, thiabendazole ( trong cam), tolyfluanid, và trifluralin. Đõy là cỏc thuốc trừ sõu được lựa chọn để phõn tớch trong những nụng sản đại diện cho chỳng, và phương phỏp cú thể ỏp dụng cho nhiều loại húa chất bảo vệ thực vật trờn cỏc nụng sản khỏc [18].
Nguyờn tắc:
Phương phỏp sử dụng ACN để chiết dư lượng thuốc BVTV ra khỏi nụng sản, tỏch lớp pha hữu cơ và pha nước ở trong mẫu bằng MgSO4 . Làm sạch bằng cỏch chiết phõn tỏn pha rắn (SPE) để loại bỏ cỏc xớt hữu cơ, lượng nước thừa, cỏc hỗn hợp khỏc cựng với một sự kết hợp của chất hấp thụ (PSA) và MgSO4. Sau đú dịch chiết được phõn tớch bằng thiết bị (MS) .
Hỡnh 1. 10: Quy trỡnh chiết mẫu AOAC 2007.01
Mẫu (>1kg) được cắt nhỏ ra, lấy khoảng 200g mẫu đại diện và đồng nhất bằng thiết bịđồng nhất mẫu
Chuyển 15g mẫu đó đồng nhất vào ống Teflon 50ml Thờm 15ml 1% CH3OOH trong ACN +1,5g NaCH3COO+6g
MgSO4+7,5àl dung dịch nội chuẩn
Lắc mạnh trong khoảng 1 phỳt, sau đú ly tõm với tốc độ >1500 vũng /phỳt và trong 1 phỳt
Chuyển 1-8ml vào ống trong đú đó cú 150mg MgSO4+50 mg PSA/ml dịch chiết và lắc trong khoảng 30 giõy
Ly tõm >1500 vũng/phỳt trong khoảng 1 phỳt
Chuyển 0,25 ml trong bước 10 vào trong ống ly tõm. Thờm 0,4 ml TPP và 1ml toluen
Chuyển 0,5-1 ml dịch chiết vào vial 2 ml của GC và thờm nội chuẩn Triphenyl Phosphat. Chuyển 0,15-0,3 ml vào vial 2 ml của LC và
thờm 0,.45-0,9ml của 6,7 mM axit formic
Cho bay hơi ở 50oC bằng N2 tới khi được 0,3-0,5 ml. Thờm toluen để được 1 ml. Sau đú thờm MgSO4để tăng lờn 0,2 ml và lắc xoỏy để
>6ml trờn vạch
Ly tõm >1500 vũng/phỳt trong 1 phỳt. Chuyển 0,6ml vào trong vial 2 ml của GC Phõn tớch bằng thiết bị (LVI) GC/MS và LC/MS/MS
Sơ đồ hỡnh 1.10 phỏc thảo quy trỡnh dự kiến. Dịch chiết cuối cựng được chuyển vào ống của bơm tựđộng và phõn tớch bằng GC/MS và LC/MS/MS để định tớnh và định lượng một dóy rộng dư lượng thuốc trừ sõu. Đểđạt được mức giới hạn xỏc định thấp (10ng/g) với thiết bị GC/MS, thỡ cần tăng lượng thể tớch mẫu bơm vào mỏy ( 8ul ), hoặc dịch chiết cuối cựng được cụ đặc lại và thay đổi dung mụi bằng toluen ( lượng cơ chất/dung mụi cuối khoảng 4g/ml), trong trường hợp này ta dựng 2 ul bơm vào mỏy và sử dụng chếđộ bơm khụng chia dũng (splittless).
Cả hai thiết bị GC/MS và LC/MS/MS bị ảnh hưởng của cơ chất mẫu trong phõn tớch dư lượng thuốc trừ sõu. Để loại trừảnh hưởng này, cỏc điểm dung dịch chuẩn phải pha trong cơ chất mẫu.. Lượng mẫu và thể tớch dịch chiết cuối cựng là khỏc nhau đối với một vài phũng thớ nghiệm. Phụ thuộc vào hàm lượng nước của cơ
chất, với 15 g mẫu với mỗi loại thờm 11-15ml ACN đầu tiờn, sau đú được ly tõm. Bằng cỏch dựng muối MgSO4 – CH3COONa, khoảng một nửa dịch chiết thụ này bị
nằm ở trong hỗn hợp muối (dạng bột mịn ). Vỡ vậy ta chỉ thu khoảng 6-7 ml của dịch chiết cuối cựng cho 15 g mẫu. Cú hai phương ỏn được dưa ra trong phương phỏp của AOAC2007-01 này để tớnh toỏn cho tỡnh huống sử dụng chuẩn trong nền matrix hoặc trong nền dung mụi : [18].
Phương ỏn A: nếu phũng thớ nghiệm cú thể bơm vào mỏy với một lượng thể
tớch lớn thỡ một hoặc hai ml dịch chiết thụ được cho vào để chiết khuyếch tỏn pha rắn ( thể tớch để chiết qua SPE phụ thuộc vào sự phự hợp của chất phõn tớch và loại mỏy ly tõm và cỏc ống ly tõm trong phũng thớ nghiệm). Thể tớch chiết thu được là 0,5 ml nếu 1 ml dịch thụ được cho vào SPE phõn tỏn, và 1 ml nếu 2 ml dịch thụ đi xuống trong bước làm sạch.
Phương ỏn B: nếu lượng thể tớch bơm mẫu lớn khụng cú giỏ trị đối với một
số thiết bị GC/MS, thỡ 30 ml dịch chiết thụ của mẫu trắng là cần thiết để làm sạch qua SPE để chuẩn bị cho việc pha cỏc điểm chuẩn trong matrix( hoặc lớn hơn 60 ml dịch chiết đầu tiờn) . Trong trường hợp này, 6 mẫu trắng với lượng cõn 15 g
lượng 8ml của 7 mẫuđược phõn bổ vào 7 ống chiết khuyếch tỏn pha rắn cú chứa 0.4g PSA +1.2g MgSO4 khan. [18].
Như vậy theo AOAC 2007.01 thỡ giai đoạn đầu thờm ACN cú 1% axit axetic và sử dụng muối NaCOOCH3 thay cho NaCl. Trong khi đú tiờu chuẩn Chõu Âu EN 15662 lại quy định khắt khe hơn với mỗi nhúm nụng sản phải sử dụng một bộ kit của nhà sản suất đó được chứng minh, kiểm định. Ngoài ra thiết bị phõn tớch phải là khối phổ (khuyến khớch MS-MS) [17].
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng, mục tiờu và nội dung nghiờn cứu
2.1.1. Đối tượng nghiờn cứu
Sử dụng cỏc húa chất bảo vệ thực vật trong nụng nghiệp đó, đang và sẽ trở
thành cụng cụ khụng thể thiếu đối với nước ta. Song chỳng cũng gõy ra những tỏc
động khụng mong muốn cho con người và mụi trường. Điều tra của Cục BVTV cho thấy thực trạng bỏo động về ụ nhiễm hoỏ chất và vi sinh vật độc hại trong nụng sản. Tỷ lệ mẫu cú dư lượng thuốc BVTV vượt mức cho phộp thay đổi theo từng đối tượng nụng sản, theo từng năm, và cú chiều hướng tăng lờn, khụng thể kiểm soỏt
được nhất là tại cỏc vựng chuyờn canh, sản xuất mang tớnh hàng hoỏ. Đặc biệt tỡnh trạng sử dụng thuốc kớch thớch tăng trưởng tràn lan khụng rừ nguồn gốc trờn rau xanh tại một số vựng trồng rau ở thành phố Hà Nội gõy lo lắng cho người tiờu dựng.
Vỡ vậy việc điều tra nghiờn cứu tiến hành khảo nghiệm, phõn tớch loại thuốc kớch thớch sinh trưởng hiện nay đang sử dụng là hết sức cần thiết để đảm bảo vệ
sinh an toàn thực phẩm cho người tiờu dựng, để làm cơ sở phục vụ cho cụng tỏc quản lý nhà nước.
Đối tượng cõy trồng được nghiờn cứu trong đề tài luận văn là rau xà lỏch (Lactuca sativa Capitala) và rau cải (Brassica rapa L.) thu thập tại cỏc vựng trồng rau trờn địa bàn thành phố Hà Nội
2.1.2. Mục tiờu và nội dung nghiờn cứu
- Điều tra tỡnh hỡnh sử dụng thuốc kớch thớch sinh trưởng đang sử dụng trờn rau hiện nay. Trờn cơ sở đú thống kờ xỏc định loại thuốc, hoạt chất KTST được dựng phổ
biến.
- Xỏc định loại hoạt chất, hàm lượng thuốc kớch thớch sinh trưởng sử dụng phổ
biến trờn rau.
- Phõn tớch chất lượng rau dưới tỏc dụng của thuốc kớch thớch sinh trưởng và hiệu lực sinh học của thuốc trờn đồng ruộng.
- Xõy dựng phương phỏp phõn tớch dư lượng axit Giberilic trong rau trờn thiết bị HPLC-MS/MS.
- Phõn tớch dư lượng GA3 trong mẫu rau từđú xỏc định thời gian cỏch ly – PHI.
2.2. Húa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Chuẩn bị dung mụi pha động và dung dịch chuẩn
- Chuẩn bị dung mụi pha động
Dung dịch kờnh A: MeOH/H2O (2 : 8) (v/v) + 5mM CH3COOH : Lấy 200ml MeOH cho vào bỡnh định mức 1 lit dựng pipetman lấy chớnh xỏc 0,288 ml glacical axit axetic, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần khử ion, lắc kỹ, siờu õm 15 phỳt. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 àm trước khi đưa vào hệ thống HPLC-MS/MS.
Dung dịch kờnh B: MeOH/H2O (9 : 1) (v/v) + 5mM CH3COOH : Lấy 900ml MeOH cho vào bỡnh định mức 1lit, dựng pipetman lấy chớnh xỏc 0,288 ml glacical acid axetic, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần khử ion, lắc kỹ, siờu õm 15 phỳt. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 àm trước khi đưa vào hệ thống HPLC-MS/MS.
- Chuẩn bị dung dich chuẩn
+ Dung dịch chuẩn gốc – 1000 àg/ml
Cõn khoảng 0,01g chất chuẩn GA3 chớnh xỏc tới 0,00001g vào bỡnh định mức 10 ml, hoà tan và định mức tới vạch bằng axetonitril được dung dịch chuẩn gốc. Chỳ ý: Do chất chuẩn bảo quản ở - 20oC nờn phải đưa về nhiệt độ phũng trước khi cõn. Dung dịch chuẩn sau khi pha bảo quản ở 0 -5 oC
+ Dung dịch chuẩn làm việc
Bằng cỏch pha loóng liờn tục và định mức bằng hồn hợp dung mụi pha động và ACN theo tỷ lệ thể tớch 1 : 1 được cỏc mức nồng độ chuẩn làm việc 2, 5, 10, 20, 40 ng/ml.
2.2.2. Cỏc hoỏ chất khỏc
Cỏc loại húa chất dựng trong phương phỏp phõn tớch đều thuộc loại húa chất tinh khiết phõn tớch (P.A.) gồm :
- Chất chuẩn Gibberellic Axit 98% - Axit axetic băng 99,8%
- Acetonnitril ACN - Magie sunphat MgSO4 - Natri clourua NaCl
- Natri sunphat khan Na2SO4 (hoạt húa 130oC trong 8 giờ, để nguội, cho vào bỡnh đậy kớn, bảo quản trong binh hỳt ẩm)
- Khớ nitơ 99,999%
- Amoni axetat (CH3COONH4)
2.2.3. Dụng cụ
- Bỡnh định mức dung tớch 10ml±0,04 ; 20ml±0,04 ; 50ml±0,06 - Ống đong dung tớch 100ml, 200ml, 1000ml
- Ống nghiệm bằng nhựa bề mặt bền trơ, cú nắp xoỏy dung tớch 10ml, 50 ml - Pipet loại 0,2ml±0,001; 0,5ml±0,01; 1ml±0,01; 2ml±0,01; 5ml±0,03; 10ml±0,05 - Pipet tựđộng loại 10 ml, 1 ml - Pipetman loại P 20 – 200 àl, P 200 - 1000àl - Ống nghiệm phõn tớch 15ml - Ống đựng mẫu chiết 2,0 ml 2.2.4. Thiết bị
- Mỏy sắc kớ lỏng khối phổ LC-MS/MS 6410MS (Agilent) - Cột Zorbax SB18 150mm x 4,6mm, 5àm
- Mỏy sắc ký lỏng HPLC 1100 ( Agilent ) - Cột Zorbax SB C18 250mm x 4,6mm, 5àm
- Cõn phõn tớch cú độ chớnh xỏc đến 0,00001 g - Cõn kỹ thuật cú độ chớnh xỏc đến 0,1 g
- Thiết bị trộn hợp Ultra Turrax T25 ( điều chỉnh tốc độ nghiền )
- Mỏy ly tõm Rotina 38R buồng lạnh 5 – 40oC, tốc độ ly tõm 1000 – 15000 vũng/phỳt
- Mỏy Vortex Genie 2TM điều chỉnh tốc độ lắc - Mỏy đo pH: pH Meter 744
- Mỏy siờu õm Sonorex Super RK514BH kết hợp gia nhiệt bể siờu õm, thời gian siờu õm tựy biến ( 1-15 phỳt)
2.3. Phương phỏp nghiờn cứu
2.3.1. Điều tra tỡnh trạng sử dụng thuốc KTST trờn rau tại Hà Nội
Tiến hành điều tra tại cỏc điểm nghiờn cứu thụng qua phiếu điều tra kết hợp với phỏng vấn trực tiếp nụng dõn. Lấy 4 huyện làm đơn vịđiều tra, mỗi huyện điều tra tại cỏc vựng sản xuất rau chuyờn canh. Điều tra 30 hộ nụng dõn/ huyện, tổng số điều tra 120 hộ. Cỏc hộ nụng dõn tham gia phỏng vấn được thực hiện một cỏch ngẫu nhiờn.
Nội dung điều tra gồm : Số hộ nụng dõn sử dụng thuốc KTST, chủng loại thuốc KTST sử dụng, liều lượng sử dụng, loại cõy rau và số lần phun thuốc trong một lứa rau.
2.3.2. Khảo nghiệm hiệulực kớch thớch sinh trưởng và xỏc định thời gian cỏch ly
2.3.2.1. Phương phỏp bố trớ thớ nghiệm
Tiến hành thớ nghiệm ở diện hẹp, cỏc ụ được bố trớ theo kiểu khối ngẫu nhiờn
đầy đủ [1, 7 ].
- Diện tớch ụ: 50m2 - Nhắc lại: 03 lần
Bảng 2. 1: Cụng thức thớ nghiệm khảo nghiệm thuốc KTST STT Tờn thuốc khảo nghiệm Liều lượng (ppm) Ghi chỳ 120 Liều lượng nụng dõn sử dụng (Gấp 5 lần khuyến cỏo ) 1 “Tăng phọt 920”
( Thuốc ngoài danh mục )
240 Gấp đụi liều lượng nụng dõn sử dụng (Gấp 10 lần khuyến cỏo ) 120 Liều lượng nụng dõn sử dụng (Gấp 5 lần khuyến cỏo ) 2 ”Viờn sủi GA3”
( Thuốc ngoài danh mục )
240 Gấp đụi liều lượng nụng dõn sử dụng (Gấp 10 lần khuyến cỏo ) 25 28 Liều khuyến cỏo 3 An khang 20 WT Megafarm 20 WP
( Thuốc trong danh mục ) 50 56
Gấp đụi liều khuyến cỏo 4 Đối chứng - Khụng xử lý
- Lượng nước thuốc phun : 400 l/ha - Dụng cụ : Bỡnh đeo vai
Thời gian xử lý thuốc
+ Rau xà lỏch: Xử lý ngày 27/3/2010 (17 ngày sau trồng) + Rau cải: Xử lý ngày 10/4/2010 (14 ngày sau trồng)
Thời gian thu hoach rau
+ Rau xà lỏch: Thu hoạch ngày 6/4/2010 (10 ngày sau xử lý) + Rau cải: Thu hoạch ngày 24/4/2010 (14 ngày sau xử lý)
2.3.2.2. Chỉ tiờu và phương phỏp điều tra
Chỉ tiờu theo dừi :
- Chiều cao cõy (đối với rau cải, xà lỏch) và đường kớnh tỏn cõy đối với xà lỏch ở trước xử lý và 3, 7, 10 (hoặc 14) ngày sau xử lý và một ngày trước thu hoạch
- Khối lượng trung bỡnh cõy (g/cõy) và năng suất (tấn rau tươi/ha)
- Ảnh hưởng xấu của thuốc với cõy rau 1,3,7,14 ngày sau phun theo Quy phạm khảo nghiệm trờn đồng ruộng số 10 TCN415 – 2000 của Bộ Nụng nghiệp và PTNT như sau :
Cấp triệu trứng nhiễm độc của cõy trồng : 1 – Cõy bỡnh thường
2 – Sinh trưởng cõy giảm nhẹ
3 – Ngộđộc tăng lờn, sinh trưởng của cõy giảm nhưng triệu chứng ( màu sắc, hỡnh dạng ...) chưa rừ ràng.
4 – Cú triệu chứng ngộđộc nhưng chưa ảnh hưởng đến năng suất 5 – Cõy biến màu thuốc gõy ảnh hưởng đến năng suất
6 – Thuốc làm giảm năng suất ớt
7 – Thuốc gõy ảnh hưởng nhiều tới năng suất 8 –Triệu chứng ngộđộc tăng dần tới làm chết cõy 9 – Cõy bị chết hoàn toàn
Phương phỏp theo dừi
- Chiều cao cõy : Đo từ mặt đất lờn đỉnh lỏ cao nhất tại 5 điểm trờn ụ, mỗi điểm 4 cõy - Khối lượng trung bỡnh (kg tươi/cõy) được lấy mẫu tai 5 điểm trờn ụ, mỗi điểm 1 cõy - Năng suất rau tươi tớnh toàn ụ khi thu hoạch
2.3.2.3. Xỏc định ảnh hưởng của thuốc đối với chất lượng rau
Cỏc chỉ tiờu xỏc định về chất lượng rau và phương phỏp xỏc định cỏc chỉ tiờu này như sau :
+ Hàm lượng chất khụ(%): xỏc định theo phương phỏp sấy khụ đến khối lượng khụng đổi và cõn
+ Hàm lượng diệp lục: xỏc định theo phương phỏp so màu
+ Hàm lượng Vitamin C: xỏc định theo phương phỏp chuẩn độ 2,6 D