3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3.1.Ảnh hưởng của nồng độ OCTS và hàm lượng nano bạc đến kích thước
trung bình hạt nano bạc và độ nhớt của dung dịch
Nồng độ OCTS (COCTS) và hàm lượng nano bạc (CnAg) ảnh hưởng lớn đến kích thước trung bình hạt bạc và độ nhớt của OCTS/nAg, ảnh hưởng đến khả năng ổn định của hạt nano bạc. Kết quả khảo sát được trình bày trong Bảng 3.3.
Kết quả Bảng 3.3 cho thấy, COCTS và CnAg có ảnh hưởng đến kích thước trung bình (dtb) của hạt nano bạc trong OCTS/nAg và độ nhớt của OCTS/nAg. Giữa các nghiệm thức thí nghiệm có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05 (p < 0,05; phụ lục 8). Kích thước trung bình của hạt nano bạc giảm và ổn định hơn theo chiều tăng của COCTS. Khi hàm lượng nano bạc tăng có hiện tượng kết tụ hạt nano bạc làm kích thước trung bình hạt nano bạc tăng nhưng không tăng nhiều so với kích thước nguyên liệu ban đầu (dtb = 18,2 ± 2,4 nm). Khi COCTS tăng từ 4 – 5% thì
dtb của nano bạc giảm mạnh còn khoảng 15 – 20 nm và độ nhớt của dung dịch cũng tăng lên đáng kể (độ nhớt tăng tuyến tính với nồng độ OCTS). Ở nồng độ OCTS 5,5% độ trong và độ đồng nhất của dung dịch kém hơn các nghiệm thức còn lại.
Bảng 3.3. dtb (nm) và độ nhớt [] của OCTS/nAg phụ thuộc vào COCTS và CnAg
STT COCTS (%) CnAg (ppm) dtb (nm) [] (ml/g) 1 4 30 48 2988 2 4,5 30 37 3358 3 5 30 20 3728 4 5,5 30 13 4093 5 4 40 46 2976 6 4,5 40 35 3354 7 5 40 23 3708 8 5,5 40 12 4081 9 4 50 52 2969 10 4,5 50 40 3346 11 5 50 20 3718 12 5,5 50 14 4067 13 4 60 37 2984 14 4,5 60 28 3358 15 5 60 17 3725 16 5,5 60 8 4058
CnAg ảnh hưởng ít đến tính chất (độ nhớt, độ trong và độ tan của OCTS trong nước) của OCTS/nAg. Theo tác giả Natarajan Velmurugan (2009) hàm lượng nano bạc trong màng CTS từ 50 – 100 ppm (dtb = 100 – 200 nm) có hiệu quả tiêu diệt nấm bệnh tốt nhất. Tác giả Bùi Duy Du (2009) chỉ ra rằng chỉ cần hàm lượng nano bạc 5 – 10 ppm (dtb 10 nm) đã có khả năng tiêu diệt các loại nấm bệnh trên cây trồng rất hiệu quả. Mặc khác, để tạo được màng thì cần COCTS từ 0,2% trở lên. Thí nghiệm này được chúng tôi bố trí theo phương pháp bề mặt đáp ứng (response surface) nhằm xác định COCTS và CnAg tối ưu, mục đích tạo thành dung dịch gốc có
thể pha loãng nhiều lần để sử dụng mà vẫn giữ được khả năng ổn định của dung dịch OCTS/nAg như kích thước trung bình hạt nano bạc và độ trong của dung dịch. Trên đồ thị và biểu đồ bề mặt đáp ứng của dtb với phương trình hồi quy: dtb = – 0,021 (CnAg)2 – 23,4 (COCTS) – 0,0185 (CnAg) + 149,475 và độ nhớt với phương trình hồi quy: [] = 0,05 (CnAg)2 – 19,75 (COCTS)2 – 0,0363 (CnAg) + 730,45 (COCTS) + 79,0813. Xác định thành phần OCTS/nAg thích hợp có COCTS 5% và CnAg 50 ppm (Hình 3.20).
Hình 3.20. Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của COCTS và CnAg đến dtb và [] của OCTS/nAg.
Hình 3.21. Phổ UV– vis của CTS, CTS/Ag+, OCTS/nAg.
Kết quả Hình 3.21 cho thấy, dung dịch CTS có một đỉnh hấp thụ cực đại tại
max 285 nm với cường độ yếu, bước sóng max = 278 – 285 nm là bước sóng hấp thụ đặc trưng của nhóm – C = O, đây có thể là do sự ion hóa nhóm amin (– NH2 + H+ – NH3+) của OCTS. Dung dịch CTS/Ag+ có đỉnh hấp thụ đặc trưng của phức CTS/Ag+ tại max = 296 nm (Long D. và ctv, 2007), còn sau khi pha chế đỉnh hấp thụ cực đại dịch chuyển sang vùng khả khiến max 408,5 nm là đỉnh đặc trưng của OCTS/nAg (Đặng Văn Phú và ctv, 2008; Bùi Duy Du và ctv, 2010). Kết quả này cũng tương tự như nghiên cứu của Murugadoss (2008) và Chen. P (2007).
Trên phổ UV– vis Hình 3.22 và Bảng 3.3 cho thấy, khi COCTS tăng từ 4% đến 5,5%, max của các OCTS/nAg chuyển dịch từ 410,5 – 399,5 nm, mật độ quang E tăng từ 0,82 – 1,2 và làm kích thước trung bình hạt nano bạc giảm từ 45,8 6,3 nm xuống 11,8 2,6 nm.
Như vậy, COCTS có ảnh hưởng đáng kể đến E, max và dtb của OCTS/nAg. OCTS ở nồng độ cao thể hiện khả năng ổn định nano bạc tốt hơn OCTS ở nồng độ thấp (Bảng 3.3 và Hình 3.22). Tuy nhiên ở nồng độ 5,5%, OTCS có sự nối mạch polymer của CTS làm ảnh hưởng đến cấu trúc và đặc tính vật lý của OCTS/nAg như: độ trong của dung dịch giảm do hiện tượng một số phân tử OCTS có MW lớn không hòa tan hoàn toàn ở pH trung tính.
Hình 3.23. Sự biến đổi dtb của OCTS/nAg theo nồng độ OCTS khác nhau. Hình 3.23 thể hiện kích thước trung bình hạt nano bạc 50 ppm sử dụng OCTS 5% với Mw = 65 kDa đạt từ 17 – 23 nm. Mối liên hệ giữa kích thước trung bình hạt nano bạc và COCTS như sau: dtb (nm) = – 11,7 COCTS + 57,4 (R2 = 0,9888).
Kết quả trong Bảng 3.3 cho thấy, khi nồng độ tăng thì kích thước trung bình của hạt nano bạc giảm, ở COCTS 4% kích thước trung bình hạt nano bạc là 45,8 nm và giảm xuống 11,8 nm khi COCTS 5,5%. Với COCTS trong khoảng từ 5% đến 5,5%, kích thước trung bình hạt nano bạc của các mẫu OCTS/nAg đạt được dtb ~ 10 – 20 nm, các hạt chủ yếu là hình cầu phân bố kích thước hình chuông. Ảnh TEM trên Hình 3.24; Hình 3.25; Hình 3.26 và Hình 3.27 thể hiện sự phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong OCTS/nAg với COCTS khác nhau.
Hình 3.24. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong OCTS/nAg (4 %/50 ppm).
Hình 3.25. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong OCTS/nAg (4,5%/50 ppm).
Hình 3.26. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong OCTS/nAg (5%/50 ppm)
Hình 3.27. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong OCTS/nAg (5,5%/50 ppm)
Như vậy, ở nồng độ OCTS 5% đã đủ để kích thước trung bình của hạt nano bạc khoảng 15 – 20 nm và bắt hoàn toàn các gốc tự do •OH sinh ra để bạc kim loại (Ag0)không bị oxy hóa chuyển thành bạc ion (Ag+).
COCTS 5% là thích hợp, theo kết quả này thì tỉ lệ khối lượng nAg và OCTS là 1/1000, bằng 1/4 tỉ lệ của Chen (2007), bằng 1/12 tỉ lệ của Long (2007) nên đảm bảo cho OCTS thể hiện vai trò chất ổn định và chất bắt gốc tự do. Mặt khác, trong các nghiên cứu của Chen (2007) và Long (2007) cũng chưa xác định nồng độ chất ổn định.
Kết quả Hình 3.28 cho thấy OCTS chỉ có 1 góc nhiễu xạ ~ 200, trong khi OCTS/nAg có thêm các góc nhiễu xạ tại 380, 440, 640 và 770 là góc nhiễu xạ tia X đặc trưng của nano bạc lập phương tâm diện (fcc).
3.3.2. Ảnh hưởng của pH đến kích thước trung bình hạt nano bạc trong OCTS/nAg
Chitosan được biết đến là hoạt chất sinh học chỉ tan trong môi trường acid do CTS có MW lớn. OCTS có MW thấp hơn nhiều nên tính tan của OCTS được cải thiện, độ pH ít ảnh hưởng đến độ tan của OCTS, tới khả năng ổn định kích thước trung bình hạt nano bạc. Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH đến đến kích thước trung bình hạt nano bạc
pH 4 5 6 7 8 9 dtb (nm) 26,8 2,4 a 24,1 2,8 ab 20,0 1,4 ab 19,5 1,3 b 21,4 2,1 ab 24,6 4,6 ab Ghi chú: Trong cùng một hàng số liệu các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa = 0,05.
Kết quả trong Bảng 3.4 cho thấy, pH có ảnh hưởng không đáng kể đến dtb của nano bạc trong dung dịch OCTS/nAg và giữa các nghiệm thức không có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức ý nghĩa = 0,05 (phụ lục 9). Cụ thể, OCTS/nAg chế tạo từ pH acid (pH ~ 4) có dtb = 26,8 nm, kích thước trung bình hạt nano bạc cao hơn so với OCTS/nAg được điều chỉnh pH = 6– 8 (dtb = 19,5 – 21,4 nm). Đồng thời, mẫu OCTS/nAg ở pH = 6 và 7 (Hình 3.29 và Hình 3.30) có phân bố kích thước hẹp (18,6 – 22,4 nm) hơn so với các mẫu OCTS/nAg ở pH = 4 và pH từ 7 – 9.
Hình 3.30. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc ở pH = 7 Chúng tôi cho rằng, ở pH thấp thì nồng độ H+ ban đầu cao sẽ thuận lợi cho quá trình hấp phụ Ag+ lên nguyên tử bạc dẫn đến tăng kích thước trung bình hạt. Ảnh hưởng của pH đến độ ổn định nano bạc trong dung dịch cũng được Ramnani S.P và ctv (2009) nghiên cứu, keo nano bạc/SiO2 ổn định tốt trong môi trường acid đến trung tính. Trong môi trường kiềm SiO2 bị hoà tan làm giảm hiệu quả ổn định keo nano bạc. Theo Chou K.S. and Ren C.Y. (2000) và Long D. và ctv (2007) trước đó thì trong môi trường kiềm, hạt bạc bị oxy hóa và keo tụ.
Qua kết quả thí nghiệm và biện luận cho thấy chọn pH = 6 – 7 là thích hợp để điều chế OCTS/nAg.
3.3.3. Khảo sát sựổn định của OCTS/nAg theo thời gian
Các thông số được khảo sát là E, max trong phổ UV – vis, kích thước trung bình hạt bạc trên cơ sở ảnh TEM. Kết quả biểu diễn ở Bảng 3.5 và Hình 3.31 cho thấy, mẫu OCTS 5%/nAg50 ppm không pha loãng ổn định sau 6 tháng. Tuy nhiên khi mẫu OCTS 5%/nAg50 ppm được pha loãng bằng nước khử ion với tỉ lệ 1/10 thì mật độ quang E giảm theo thời gian. Sau 3 tháng E giảm xuống còn 39,3% và sau 6 tháng thì giảm còn 22,3% so với ban đầu. Bước sóng hấp thụ cực đại max của mẫu OCTS 5%/nAg50 ppm pha loãng có xu hướng dịch chuyển sang vùng ánh sáng đỏ (~ 423 nm) và dao động không đổi quanh vùng 423 nm theo suốt quá trình lưu giữ đến 6 tháng. Sự giảm E và tăng max chứng tỏ, trong dung dịch OCTS 5%/nAg50 ppm có sự kết tụ của nano bạc hình thành hạt có kích thước lớn hơn. OCTS/nAg pha loãng bằng nước sau 6 tháng, dtb từ 20,6 nm tăng lên đến ~ 32,4 nm và phân bố
kích thước trong khoảng rộng đến 56 nm so với thời điểm ban đầu (phân bố kích thước trong khoảng hẹp đến 18 nm) (Hình 2.32).
Bảng 3.5. Độ ổn định của OCTS/nAg theo thời gian lưu giữ
Thời gian (t) dtb (nm) max (nm) E 100Et/E0 [] (ml/g) Không pha loãng 0 tháng 20,6 ± 2,2 a 408,5 1,12 100,0 3689 ± 45 a 1 tháng 21,7 ± 2,1 a 411,5 1,08 89,3 3710 ± 80 ab 2 tháng 21,9 ± 2,5 a 418,0 1,08 96,4 3756 ± 78 ab 3 tháng 22,5 ± 1,9 a 418,5 1,04 92,9 3761 ± 80 ab 4 tháng 23,9 ± 2,5 a 417,5 1,06 94,6 3796 ± 60 ab 5 tháng 24,4 ± 1,3 a 417,0 1,15 102,7 3843 ± 48 ab 6 tháng 24,6 ± 1,8 a 416,0 1,10 98,2 3854 ± 53 b Pha loãng (1/10) 0 tháng 20,6 ± 2,2 a 408,5 1,12 100,0 3689 ± 45 a 1 tháng 24,2 ± 1,8 bc 422,5 0,60 53,6 3762 ± 80 a 2 tháng 25,1 ± 2,4 bc 424,5 0,54 48,2 3808 ± 78 ab 3 tháng 26,0 ± 2,1 bc 423,5 0,44 39,3 3884 ± 48 ab 4 tháng 28,0 ± 2,1 b 423,5 0,40 35,7 3982 ± 121 b 5 tháng 29,1 ± 2,0 b 423,5 0,32 28,6 4027 ± 50 b 6 tháng 32,4 ± 3,8 b 424,5 0,25 22,3 4042 ± 23 b Ghi chú: Trong cùng một cột số liệu các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa = 0,05. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 1 2 3 4 5 6 Thời gian lưu giữ (tháng) d tb , n m
Không pha loãng Pha loãng (1/10)
a) Không pha loãng.
b) Pha loãng với tỉ lệ 1/10.
Hình 3.32. Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong OCTS/nAg sau 6 tháng lưu giữ.
Kết quả này cũng chứng tỏ dung dịch OCTS 5%/nAg 50 ppm vẫn còn tính kị nước, nếu pha loãng OCTS 5%/nAg 50 ppm keo bạc nên sử dụng ngay.
3.4. Quy trình công nghệđiều chế OCTS/nAg
Từ những kết quả của thí nghiệm đã thực hiện, quy trình công nghệ điều chế OCTS/nAg được trình bày theo Hình 3.33.
Hình 3.33. Sơ đồ quy trình điều chế OCTS/nAg. Chitosan (Mw = 460 kDa, DDA = 75%) AgNO3 HH Chitosan + A.lactic Oligochitosan (Mw = 50 kDa, DDA = 75%) DD OCTS 0,5% Dung dịch acid lactic 1% Dung dịch Chiếu xạ γCo-60 (Dbh = 16 kGy) Keo nano bạc (500 ppm) Hỗn hợp OCTS + nAg C2H5OH DD OCTS H2O2 6%, t = 10 giờ DD/chitosan = 10/1 Kết tủa trong cồn 96 Cồn/OCTS = 2/1 OCTS/nAg (pH = 6, OCTS 5%, nAg 50 ppm) Khuấy 30 phút Để ỗn định 4 giờ
3.5. Thử invitro hiệu lực kháng nấm Phytophthora và nấm Colletotrichum của OCTS/nAg
3.5.1. Hiệu lực kháng nấm của OCTS/nAg dạng dung dịch
Chế phẩm OCTS/nAg được khuếch tán vào môi trường thạch PDA theo độ pha loãng 25 lần (OCTS 0,2%/nAg 2 ppm), 16,7 lần (OCTS 0,3%/nAg 3 ppm), 12,5 lần (OCTS 0,4%/nAg 4 ppm), 10 lần (OCTS 0,5%/nAg 5 ppm) và 8,3 lần (OCTS 0,6%/nAg 6 ppm) của OCTS 5%/nAg 50 ppm, tiến hành song song nghiệm thức so sánh (CTS 1%, OCTS 1% )và nghiệm thức đối chứng không sử dụng OCTS/nAg. Kết quả kháng từng loại nấm được trình bày lần lượt ở mục 3.5.1.1 và 3.5.1.2.
3.5.1.1. Hiệu lực kháng nấm Phytophthora của OCTS/nAg dạng dung dịch
Khả năng kháng nấm Phytophthora của OCTS/nAg dạng dung dịch được trình bày ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Đường kính tản nấm (dT) Phytophthora và IC50 của OCTS/nAg dạng dung dịch. STT Nghiệm thức dT (mm) % ức chế IC50 1 OCTS 0,2%/nAg 2 ppm 67,7 ± 1,5 b 24,8 OCTS 0,32%/nAg 3,2 ppm 2 OCTS 0,3%/nAg 3 ppm 47,3 ± 3,1 d 47,4 3 OCTS 0,4%/nAg 4 ppm 26,7 ± 2,5 e 70,3 4 OCTS 0,5%/nAg 5 ppm 13,7 ± 0,6 f 84,8 5 OCTS 0,6%/nAg 6 ppm 13,0 ± 1,7 f 85,6 6 CTS 1% 55,3 ± 2,1 c 38,6 7 OCTS 1% 50,0 ± 2,6 d 44,4 8 ĐC 90,0 ± 0,0 a 0,0
Ghi chú: Trong cùng một cột số liệu các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa = 0,05.
Từ kết quả Bảng 3.6 cho thấy sau 7 ngày nuôi cấy và thử nghiệm hoạt tính, các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa = 0,05. dT
giảm khi nồng độ OCTS/nAg tăng, chứng tỏ khi nồng độ dung dịch OCTS/nAg càng cao thì hiệu lực kháng nấm càng mạnh. Nghiệm thức OCTS 0,2%/nAg 2 ppm có nồng độ thấp nên hiệu lực kháng nấm thấp nhất trong 4 nghiệm thức sử dụng dung dịch OCTS/nAg (dT đạt 67,7 mm) khi nồng độ tăng lên từ 2,5 – 3 lần thì dT chỉ còn 13 – 13,7 mm. Trong khi đó nghiệm thức CTS 1% và OCTS 1% có hiệu lực kháng nấm Phytophthora yếu và chỉ tương đương với nghiệm thức OCTS 0,3%/nAg 3 ppm. Nghiệm thức OCTS 0,5%/nAg 5 ppm và nghiệm thức OCTS 0,6%/nAg 6 ppm không có có sự khác biệt về mặt thống kê, chọn nghiệm thức OCTS 0,5%/nAg 5 ppm có hiệu lực kháng nấm cao nhất và thích hợp nhất. Phương trình hồi quy biểu diễn tính kháng nấm Phytophthora của OCTS/nAg dạng dung dịch như sau: dT = – 7,0871 [OCTS/nAg] + 90,314 (R2 = 0,96), IC50 Phytophthora = OCTS 0,32%/nAg 3,2 ppm).
3.5.1.2. Hiệu lực kháng nấm Colletotrichum của OCTS/nAg dạng dung dịch Khả năng kháng nấm Colletotrichum của OCTS/nAg dạng dung dịch được Khả năng kháng nấm Colletotrichum của OCTS/nAg dạng dung dịch được trình bày ở Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Đường kính tản nấm (dT) Colletotrichum và IC50 của OCTS/nAg dạng
dung dịch STT Nghiệm thức dT (mm) % ức chế IC50 1 OCTS 0,2%/nAg 2 ppm 64,3 ± 2,5 b 28,6 OCTS 0,31%/nAg 3,1 ppm 2 OCTS 0,3%/nAg 3 ppm 46,7 ± 3,1 d 48,1 3 OCTS 0,4%/nAg 4 ppm 25,7 ± 2,1 e 71,4 4 OCTS 0,5%/nAg 5 ppm 12,6 ± 1,5 f 86,0 5 OCTS 0,6%/nAg 6 ppm 12,6 ± 1,2 f 86,0 6 CTS 1% 57,0 ± 2,0 c 36,7 7 OCTS 1% 52,3 ± 4,7 c 41,9 8 ĐC 90,0 ± 0,0 a 0,0
Ghi chú: Trong cùng một cột số liệu các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa = 0,05.
Từ kết quả Bảng 3.7 cho thấy sau 7 ngày nuôi cấy và thử nghiệm hoạt tính, các nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa = 0,05. Các nghiệm thức OCTS/nAg đều có hiệu lực kháng nấm Colletotrichum cao, tính kháng nấm