1.7.1. Nghiên cứu trong nước
Hiện nay, chitosan được áp dụng trong việc bảo quản cho các loại trái cây như nhãn, cà chua, chuối, cam, quít, ... Màng zein và chitosan ứng dụng trong bảo quản trứng và một số loại trái cây có giá trị kinh tế ở đồng bằng sông Cửu Long (Nguyễn Văn Mười, 2009). Kết quả thí nghiệm thăm dò cho thấy màng chitosan 1% mang lại hiệu quả bảo quản cam và trong một mức độ nào đó đối với xoài (sau khi thu hoạch được xử lý bằng dung dịch Na2CO3 1% kết hợp dung dịch benzoat natri 1%, sau đó tiến hành bao màng chitosan 1%, cho vào bao bì xốp và bảo quản ở nhiệt độ 6 – 8oC thì giữ được chất lượng và giá trị cảm quan đến ngày thứ 71). Chitosan có độ deacetyl 75% DDA sử dụng bảo quan na tốt hơn chitosan có độ
deacetyl cao (86%; 94% DDA). Quả na được xử lý bằng dung dịch chitosan 1% có độ deacetyl 75% DDA kết hợp với bao gói màng film PE độ dày 0,04 mm, bảo quản ở 100C làm chậm quá trình chín, giảm cường độ hô hấp và có thể kéo dài thời gian bảo quản đến 12 ngày mà vẫn duy trì được giá trị cảm quan và dinh dưỡng (Nguyễn Thị Hằng Phương và ctv, 2008).
Bùi Văn Miên và Nguyễn Anh Trinh (2003) đã nghiên cứu tạo màng vỏ bọc chitosan từ vỏ tôm và ứng dụng bảo quản thủy sản. Dùng dung dịch chitosan 2% trong dung dịch acid acetic 1,5% để bảo quản thủy sản, tùy theo độ ẩm của cá và mực mà sản phẩm có thời gian bảo quản khác nhau, độ ẩm càng thấp thời gian bảo quản càng dài, với độ ẩm 26 – 30%, cá khô bảo quản được 83 ngày, mực khô giữ được 85 ngày còn ở độ ẩm 41 – 45% thì cá khô giữ được 17 ngày, mực khô được 19 ngày.
Oligochitosan có cấu tạo từ 3 đến 30 gốc glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 – glycoside có tính chất kháng khuẩn rộng, khi cắt mạch chitosan bằng các phương pháp: bức xạ, thủy phân bằng enzyme, tác nhân oxy hóa H2O2. – Oligochitosan được tạo ra bằng phương pháp oxy hóa sử dụng tác nhân H2O2 (OC – 90[ox]) có khối lượng phân tử thấp nhất (MW = 9.380 Da) có hiệu ứng kháng vi sinh vật hiệu quả ở nồng độ 1%; 1,5% (Văn Thị Thu Tâm và ctv, 2009). Năm 2009, PGS.TS Lê Văn Hòa, Trường Đại học Cần Thơ và các cộng sự tiến hành nghiên cứu quy trình bảo quản trái quýt đường bằng cách bao màng chitosan ở nồng độ 0,25% kết hợp với bao Polyethylene (PE) đục 5 lỗ với đường kính mỗi lỗ 1 mm và ghép mí lại bằng máy ép, bảo quản ở nhiệt độ 120C, thời gian bảo quản đến 8 tuần vẫn giữ được hàm lượng đường, hàm lượng vitamin C ... luôn ổn định, tỷ lệ hao hụt khối lượng thấp, màu sắc vỏ trái đồng đều và đẹp.
Nguyễn Duy Lâm (2010, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch), thử nghiệm mô hình sử dụng dung dịch tạo màng chitosan dùng trong bảo quản bưởi và chuối tại Hợp tác xã bưởi Năm Roi Mỹ Hòa (huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long (bưởi Năm Roi sau thời gian thu hoạch 1 tháng và chuối sau khi thu hoạch 2 tuần vẫn giữ được màu sắc tươi xanh, giữ được chất lượng tốt ở điều kiện
môi trường bình thường). Dung dịch tạo màng là một dịch lỏng dạng nhũ tương được phun xịt bao quanh bề mặt rau quả, khi dịch lỏng khô đi tạo ra một lớp màng mỏng trong suốt trên bề mặt rau quả. Lớp màng mỏng này sẽ làm giảm khả năng trao đổi khí, từ đó làm chậm quá trình chín hoặc lão hóa của sản phẩm. Dung dịch sinh học chitosan còn được ứng dụng để bảo quản chuối được tạo ra bằng cách hòa tan 1 g chitosan trong acid acetic 1% có thể ức chế nấm mốc Aspergillus niger, vi khuẩn gram âm (Pseudomonas aeruginosa) và vi khuẩn gram dương (Staphylo- coccus aureus), kéo dài thời gian bảo quản của chuối gấp 3 lần so với các mẫu đối chứng (Phạm Võ Minh Thiện, 2010).
1.7.2. Nghiên cứu ngoài nước
Chitosan dùng làm màng bao bảo quản quả dâu tây và quả mâm xôi (10 và 15 mg/ml) đã ức chế được mốc xanh và Rhizopus rot, hơn thế nữa khả năng kháng nấm của chitosan tương đương với hóa chất tổng hợp như ipriodione và thiabendazole (TBZ) (El Ghaouth và ctv., 1992; Zhang và Quantick, 1998). Đối với nấm S.Sclerotiorum chitosan ở nồng độ 2% và 4% có khả năng ức chế nấm tốt hơn iprodione và TBZ (Luna và ctv., 2001), Trong một báo cáo khác của El Ghaouth và ctv., (1997), tiến hành bảo quản quả ớt chuông bằng chitosan nồng độ 10 mg/ml kéo dài thời gian bảo quản lên đến 7 ngày. Chitosan ở nồng độ 1% và 2% đã ức chế sự phát triển của nấm P.expansum trong suốt quá trình bảo quản táo (de Capdeville và ctv, 2002). Nếu kết hợp chitosan (0,1%, 0,5% và 1,0%) với hypobaric (0,50 và 0,25 atm) để bảo quản quả anh đào, kết quả sẽ tốt hơn nếu chỉ dùng chitosan (Romanazzi và ctv, 2003).
Tác giả Xiao – Fang Li và ctv (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của trọng lượng phân tử và độ deacetyl của chitosan lên khả năng kháng nấm Aspergillus niger, kết quả ở MW = 50 kDa, nồng độ 0,1% và pH = 3 có thể ức chế đến 100 ± 1,58 %. Sử dụng màng bao chitosan ở nồng độ 2 g/l bảo quản táo cắt tươi ở 250C thì thời gian lên đến 10 ngày (Odilio Benedito Garrido Assis, 2008). Ở nồng độ này chitosan ức chế tốt sự phát triển của 2 loại nấm gây hư hỏng chủ yếu trên táo cắt tươi là Penicillium sp. và Alternaria sp.
Nadeem Akhtar và ctv (2009) nghiên cứu ảnh hưởng của lớp màng bao chitosan được chiếu xạ (CHIirr, Mv = 5,14 × 104) và không được chiếu xạ (CHIun, Mv = 2,61 × 105) trong quá trình bảo quản trái xoài sau thu hoạch (Mangifera indica L.) cho thấy ở liều chiếu xạ 200 kGy xoài có thể bảo quản trong 4 tuần ở nhiệt độ 150C và độ ẩm 85%. Kết quả khẳng định lớp màng bao chitosan chiếu xạ có một tiềm năng tuyệt vời để sử dụng bảo quản sản phẩm tươi duy trì chất lượng và kéo dài thời hạn sử dụng. Tác giả Natarajan Velmurugan và ctv (2009) cho rằng màng chitosan chứa nano bạc ở các nồng độ khác nhau: 10 ppm, 50 ppm và 100 ppm (kích thước trung bình hạt nano nằm trong khoảng 100 – 200 nm) đều ức chế tốt các loại nấm: Ophiostoma flexuosum, Ophiostoma tetropii, Ophiostoma poloni- cum, và Ophiostoma, nhưng ở nồng độ nano bạc 100 ppm, màng chitosan ứng chế 100% nấm Ophiostoma flexuosum và có khả năng ức chế cao với 3 loại nấm còn lại được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán thạch trên môi trường MEA agar.
Theo tác giả Honary S. và ctv (2011), kích thước trung bình hạt nano bạc bị ảnh hưởng bởi MW của chitosan. Nhóm tác giả nghiên cứu với 3 Mw của chitosan gồm: LMw = 100 kDa, MMw = 400 kDa và HMw = 600 kDa, kết quả cho thấy kích thước trung bình hạt nano bạc giảm theo thứ tự sau: MMw, LMw và HMw. Sự khác biệt về kích thước trung bình hạt nano bạc thể hiện khác biệt khá rõ giữa nhóm HMw(dtb = 24 – 31 nm), LMw (dtb = 50 – 70 nm) và nhóm MMw (76 – 97 nm). Jiashen An và ctv (2008) dùng màng bao chứa nano bạc (15 – 25 nm) bảo quản Green asparagus (loại rau có giá trị kinh tế cao) ở nhiệt độ từ 1 – 30C thì kéo dài được 14 – 15 ngày với mà độ hao hụt trọng lượng, hàm lượng acid ascorbic, thay đổi màu sắc không đáng kể so với ban đầu trong khi ở điều kiện thường thời gian khoảng 3 – 5 ngày. Tác giả Xinlin Li và ctv (2011) đã tiến hành nghiên cứu quá trình bảo quản dưa leo biển (sea cucumber) bằng màng bao chứa nano bạc kết hợp với sấy lạnh bằng sóng microwave, kết quả cho thấy ở nồng độ nano bạc 0,3 mg/l đã kiểm soát được 99 % vi khuẩn Bacillus subtilis.
Các tài liệu nghiên cứu đều cho thấy chitosan là hoạt chất sinh học tự nhiên không độc, dễ phân hủy, thân thiện với môi trường, có hoạt tính kháng vi sinh vật
cao, có khả năng tạo màng và đặc tính thấm của màng chitosan là ưu điểm để ứng dụng trong nghiên cứu bảo quản nông sản. Với những ưu điểm quý giá như trên nhưng chitosan lại không hòa tan trong nước mà chỉ hòa tan trong môi trường có tính acid vì vậy việc ứng dụng chitosan bị hạn chế. Để khắc phục nhược điểm trên của chitosan thường sử dụng phương pháp đơn giản là cắt mạch chitosan tạo thành các oligochitosan có khả năng tan trong nước nhưng hoạt tính kháng vi sinh vật không giảm mà còn tăng lên. Tuy nhiên, nếu Mw của chitosan < 50 kDa thì độ nhớt dung dịch chitosan cũng thấp dẫn đến khả năng ổn định hạt nano bạc không tốt gây ra hiện tượng keo tụ hạt nano bạc (Bùi Duy Du, 2009) và ảnh hưởng đến quá trình tạo màng chitosan nên không phát huy tối đa tính chất của nó. OCTS/nAg tạo ra một công nghệ bảo quản nông sản thực phẩm hoàn toàn mới khi kết hợp những ưu điểm của oligochitosan với nano bạc. Nano bạc có tính ưu việt trong ức chế, kháng vi sinh vật phổ rộng, không gây độc với người và động vật. Ở Việt Nam chưa có tiêu chuẩn nào quy định hàm lượng bạc trong thực phẩm, nước sinh hoạt và cả nước thải sinh hoạt... (Quyết định số 46/2007/QĐ – BYT – Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm; TCVN 5502 : 2003 – Nước cấp sinh hoạt, yêu cầu chất lượng; TCVN 6772 : 2000 – Chất lượng nước, nước thải sinh hoạt giới hạn ô nhiễm cho phép; Thông tư số: 25/2011/TT – BYT – Ban hành danh mục hoá chất, chế phẩm diệt côn trùng, diệt khuẩn dùng trong lĩnh vực gia dụng và y tế được phép đăng ký để sử dụng, được phép đăng ký nhưng hạn chế sử dụng và cấm sử dụng tại Việt Nam).
Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
Cắt mạch chitosan tạo thành OCTS bằng phương pháp hóa học với MwOCTS = 50 – 70 kDa.
Điều chế tạo keo nano bạc.
Pha chế OCTS mang nano bạc và khảo sát khả năng ổn định của nano bạc trong OCTS.
Thử invitro hoạt tính kháng nấm: Phytophthora, Colletotrichum.
Thử nghiệmbảo quản bưởi da xanh sau thu hoạch bằng OCTS/nAg.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài đã được thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 10/2012 tại Trung tâm Sinh học và Vật liệu mới - Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp hóa học:
Cắt mạch chitosan bằng acid HCl và H2O2 tạo oligochitosan.
Phương pháp đo phổ sắc ký thẩm thấu gel (GPC) xác định MW của OCTS:
Hỗn hợp được tách theo kích thước phân tử các chất phân bố khác nhau trong các lỗ xốp của pha tĩnh, các phân tử có kích thước nhỏ chui sâu bên trong lỗ xốp được rửa giải ra sau và ngược lại. Thời gian lưu của polymer có MW trung bình khác nhau sẽ khác nhau, so sánh với thời gian lưu của mẫu chuẩn ta có thể xác định được các MW polymer theo thời gian lưu đó với các phân đoạn tương ứng, polymer có MW càng lớn thời gian lưu càng ngắn và ngược lại. Sử dụng dung dịch rửa giải đệm 0,25 M CH3COONa/0,25 M CH3COOH và chất chuẩn là Pullulan.
Tiến hành:hòa tan OCTS trong nước với nồng độ 0,3% cho đến khi tan hoàn toàn, thêm muối 0,25 M CH3COONa/0,25 M CH3COOH, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 m. Tiêm mẫu dung dịch OCTS với thể tích khoảng 50 μl vào cột sắc ký. Mẫu chuẩn pullulan được đo trong điều kiện tương tự. Xác định thời gian lưu và so sánh với đường chuẩn để xác định MW của mẫu OCTS cần đo.
Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) xác định độ deacetyl của OCTS:
Độ deacetyl hóa của chitosan là một đặc tính quan trọng của chitosan, ảnh hưởng rất nhiều đến các tính chất của chitosan, có rất nhiều phương pháp xác định độ deacetyl hóa như phương pháp Ninhydrin, phương pháp hồng ngoại, phổ NMR, quang phổ UV… Đề tài được sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại để xác định độ deacetyl hóa của chitosan. Bột chitosan và KBr được trộn, nghiền thật kỹ trong cối, để hỗn hợp đồng nhất và nén thành đĩa tiến hành đo trên máy IR.
Độ đề axetyl (DDA%) của chitosan được xác định theo công thức của Domszy and Roberts (1985):
DA (%) = (A1655 / A3450)*(100 / 1,33) (16) Trong đó: DA: độ acetyl (degree of acetylation)
A: là cường độ hấp thụ tại đỉnh 1655 và 3450 trên phổ IR. DDA (%) = 100 – DA (17)
Tiến hành:
Mẫu chitosan được nghiền nhỏ bằng cối nghiền bi (Fritsch, Đức) và rây qua rây 200 mesh. Cân khoảng 3 – 5 mg mẫu bột OCTS trộn cùng với 100 mg KBr trong cối mã não, ép viên trên máy ép chuyên dụng trong thời gian khoảng 10 phút. Tiến hành đo phổ IR trên máy FT – IR 8400S (Shimadzu, Nhật).
Đo phổ nhiễu xạ tia X (XRD):
Dùng xác định cấu trúc mạng tinh thể của OCTS và nAg. Nguyên tắc:
Khi chiếu tia tới có bước sóng bằng khoảng cách d của tinh thể, ta có phương trình Bragg: 2d sin = n.. Trong đó: n là số nguyên; d: khoảng cách giữa hai nút mạng; là độ dài sóng, là góc tạo bởi mặt mạng với tia tới hay tia phản xạ.
Để hiện tượng nhiễu xạ xảy ra thì phương trình Bragg phải thỏa mãn, như vậy người ta phải dùng tia X có bước sóng thay đổi hoặc xoay mẫu vật.
Cường độ nhiễu xạ phụ thuộc vào số lượng điện tử trong mạng tinh thể, do đó phụ thuộc vào loại nguyên tử và vị trí của nó trong mạng. Tóm lại, mỗi tinh thể khác nhau có góc nhiễu xạ khác nhau. Các tinh thể giống nhau cho nhiễu xạ giống nhau không bị ảnh hưởng bởi chất khác. Do vậy kết quả đo nhiễu xạ dùng để xác định cấu tạo tinh thể của vật liệu bằng cách so sánh với cơ sở dữ liệu chuẩn.
Kết quả đo trên máy gồm: trục hoành – góc 2, trục tung – cường độ nhiễu xạ. Như vậy tinh thể có trong mẫu sẽ tạo 1 đỉnh trên trục hoành, đỉnh đó được so sánh với đỉnh chuẩn.
Tiến hành: OCTS/nAg được kết tủa bằng aceton, lọc lấy kết tủa, sấy khô, nghiền mịn, ép thành tấm có bán kính 1 inch, đưa vào đo phổ XRD trên máy ADVANCE 8 – Brooker (Đức), vận hành ở điện thế 40 kV, cường độ dòng 40 mA bằng bức xạ của Cu K.
Chụp ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM):
Kích thước và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc được xác định từ ảnh TEM. Nhỏ giọt keo nano bạc lên lưới đồng (300 mesh) đã phủ lớp carbon, làm khô tự nhiên, khoảng 15 phút, chụp ảnh TEM trên máy JEM1010, JEOL, Nhật bản với độ phân giải 3 Ao, điện thế gia tốc 80 kV, phim âm bản FUJIFILM kích thước 8,2 11,8 cm.
Mỗi mẫu đếm từ 500 – 1.000 hạt (~ 5 ảnh TEM) sử dụng phần mềm Photoshop CS3, Version 9.0. Kích thước trung bình hạt nano bạc (dtb, nm) được xác định theo công thức: i k i i i k i i i d n n X 1 1 / ) (
Trong đó: di (nm) là giá trị tổ thứ i của số tổ k ni là số hạt đếm được (tần số) của tổ i Phương pháp xác định giá trị độ nhớt đặc trưng [η]:
C 0
thuộc vào các lực tương tác nội phân tử. Chitosan được pha thành dung dịch trong hệ dung môi: CH3COOH 0,3 M và CH3COONa 0,2 M. Độ nhớt tương đối của dung dịch chitosan được tính theo công thức:
ηtđ = t/to (18)
Trong đó: ηtđ là độ nhớt tương đối của dung dịch chitosan.
t là thời gian dung dịch chitosan chảy qua mao quản nhớt kế. t0 là thời gian dung môi chảy qua mao quản nhớt kế.
Độ nhớt riêng ηr được tính bằng công thức:
ηr = ηtđ – 1 (19)
Độ nhớt đặc trưng hay độ nhớt là giới hạn thương số giữa độ nhớt riêng và nồng độ (C) của dung dịch chitosan (g/100 ml) khi nồng độ này tiến tới 0.
[η] = lim ηr/C (20)
Phương pháp đo phổ phát xạ nguyên tử cảm ứng plasma (ICP – AES): Nguyên lý của phương pháp:
Sự phóng điện điện áp cao trong luồng khí argon tạo ra plasma được nhận bởi nhiệt cảm ứng liên quan với trường của cuộn dây có tần số vô tuyến. Dung dịch mẫu được phun sương vào plasma, bức xạ kích thích được phân tích bằng cách sử dụng bộ đơn sắc và detector tích quang.
Trong vùng nhiệt độ cao trên 6.000 K các chất khí như argon tạo ra plasma,