Hai chủng nấm ựược nuôi cấy trên MT cơ sở là MT Czapek dịch thể ựược bổ sung pepton; cao nấm men; (NH4)2SO4; NH4NO3; NaNO3. Sau 2 tuần xác ựịnh hoạt tắnh kháng VSVKđ bằng phương pháp ựục lỗ thạch và trọng lượng sinh khối khô. Kết quả ựược thể hiện trong bảng 12, 13 và hình 12, 13.
Bảng 12. Sinh khối khô của hai chủng HT18đ và NV8T trên các nguồn nitơ khác nhau
Sinh khối khô (g/l) Chủng
Pepton Cao nấm men (NH4)2SO4 NH4NO3 NaNO3
HT18đ 8,863 8,319 4,228 5,827 3,928
NV8T 8,473 7,195 5,359 9,593 6,771
Bảng 13. Hoạt tắnh VSVKđ của 2 chủng HT18đ và NV8T trên các nguồn nitơ khác nhau Hoạt tắnh kháng VSVKđ (D-d,mm) Chủng Môi trường B. subtilis E. coli S. aureus A. niger C. albicans F. oxysporum Pepton 11 9 16 0 4 5 Cao NM 11 16 15 4 7 11 (NH4)2SO4 0 20 0 4 10 11 NH4NO3 5 18 15 5 8 7 HT18đ NaNO3 0 16 0 0 6 9 Pepton 8 0 5 0 7 0 Cao NM 8 7 5 0 19 6 (NH4)2SO4 7 0 7 6 6 0 NH4NO3 9 18 9 5 5 18 NV8T NaNO3 9 10 0 4 4 0
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 41 0 5 10 15 20 25 B.s ubtil is E.c oli S.a ureu s A.n iger C.a lbic ans F.ox yspo rum VSV kiểm ựịnh H o ạ t tắ n h k h á n g V S V K đ (D -d ,m m ) Pepton Cao NM (NH4)2SO4 NH4NO3 NaNO3
Hình 12. Hoạt tắnh kháng VSVKđ của chủng HT18đ trên các nguồn nitơ khác nhau 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 B.s ubtil is E.co li S.au reus A.n iger C.a lbic ans F.ox yspo rum VSV kiểm ựịnh H o ạ t tắ n h k h á n g V S V K đ ( D -d ,m m ) Pepton Cao NM (NH4)2SO4 NH4NO3 NaNO3
Hình 13. Hoạt tắnh kháng VSVKđ của chủng NV8T trên các nguồn nitơ khác nhau
Từ kết quả bảng 12, chúng tôi nhận thấy chủng HT18đ cho sinh khối cao nhất trên MT Czapek có pepton; chủng NV8T là MT có NH4NO3. Hình 12 cho thấy chủng HT18đ thể hiện hoạt tắnh kháng VSVKđ tốt trên MT có cao nấm men, còn chủng NV8T trên MT có NH4NO3 (hình 13). Vì vậy chúng tôi chọn nguồn nitơ thắch hợp cho sự sinh trưởng và thể hiện hoạt tắnh kháng VSVKđ của chủng HT18đ là cao nấm men; còn chủng NV8T là NH4NO3.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 42
3.4. Tách chiết và ựánh giá hoạt tắnh sinh học của các cặn chiết EtOAc thu ựược từ dịch nuôi cấy của các chủng HT18đ và NV8T
Hai chủng NNS ựược lên men trong MT khoai tây dịch thể. Sau 2 tuần, dịch nuôi ựược ựem chiết trong EtOAc (theo sơ ựồ 1). Cặn chiết EtOAc ựược ựem thử hoạt tắnh kháng VSVKđ ựể tắnh giá trị MIC và hoạt tắnh kháng sinh của các dòng tế bào ung thư người.
3.4.1.Hoạt tắnh kháng vi sinh vật kiểm ựịnh
Kết quả thử hoạt tắnh VSVKđ của các cặn chiết thô EtOAc của 2 chủng lựa chọn ựược trình bày trong bảng 14.
Bảng 14. Hoạt tắnh kháng VSVKđ của các cặn chiết EtOAc
Hoạt tắnh VSVKđ, MIC (ộg/ml) KH mẫu B. subtilis E. coli S. aureus P. aeruginosa A. niger C. albicans F. oxysporum S. cerevisiae HT18đ 100 100 100 400 100 - - - NV8T - 400 - - 400 100 - -
Kết quả bảng 17 cho thấy cặn chiết EtOAc của chủng HT18đ có hoạt tắnh kháng vi khuẩn B.subtilis, E.coli, S aureus và nấm mốc A.niger với giá trị MIC tương ứng là 100 ộg/ml. Chủng này còn biểu hiện khả năng ức chế yếu vi khuẩn P.aeruginosa với giá trị MIC là 400 ộg/ml.
Còn cặn chiết EtOAc của chủng NV8T có hoạt tắnh kháng nấm men
C.albicans với các giá trị MIC là 100 ộg/ml. Chủng này còn biểu hiện khả năng ức chế yếu các chủng vi khuẩn E.coli và nấm mốc A.niger với giá trị MIC là 400 ộg/ml.
3.4.2. Hoạt tắnh gây ựộc tế bào
Cặn chiết EtOAc của 2 chủng NNS ựược ựánh giá hoạt tắnh gây ựộc hai dòng tế bào ung thư là ung thư gan Hep-G2 và dòng tế bào ung thư phổi - LU. Kết quả ựược trình bày ở bảng 15.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 43
Bảng 15. Kết quả hoạt tắnh gây ựộc tế bào của cặn chiết thô EtOAc của 2 chủng lựa chọn Dòng tế bào (Cell survival %) Kắ hiệu mẫu Hep- G2 LU Kết luận Chứng (+) 0,32 0,35 HT18đ 38,5 ổ 0,6 50,1 ổ 0,07 Dương tắnh NV8T 60,2 ổ 0,4 96,9 ổ 0,9 Âm tắnh
Kết quả bảng 15 cho thấy chủng HT18đ dương tắnh với cả 2 dòng tế bào thử nghiệm, tỷ lệ tế bào sống sót tương ựối thấp là 38,5% ựối với dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và 50,1 % ựối với dòng tế bào ung thư phổi Ờ LU. Còn chủng NV8T âm tắnh với cả hai dòng tế bào thử nghiệm.
3.4.3.Hoạt tắnh chống oxy hóa
Hoạt tắnh chống oxy hóa của cặn chiết EtOAc của 2 chủng ựược thể hiện ở bảng 16.
Bảng 16. Kết quả hoạt tắnh chống oxy hóa của các cặn chiết
Kắ hiệu mẫu SC % Kết quả
Chứng (+) 64,05 ổ 0,7 Dương tắnh
Chứng (-) 0,00 ổ 0,0
HT18đ 78,95 ổ 0,1 Dương tắnh
NV8T 59,06 ổ 0,2 Dương tắnh
Cả 2 cặn chiết EtOAc của hai chủng NNS ựều có hoạt tắnh chống oxy hóa trên hệ DPPH, ựặc biệt chủng HT18đ có hoạt tắnh chống oxy hóa cao với SC% là 78,95.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 44
3.4.4.Hoạt tắnh enzym ngoại bào
Kết quả thử hoạt tắnh enzym ngoại bào ựược thể hiện trong bảng 17.
Bảng 17. Hoạt tắnh enzym ngoại bào của dịch nuôi cấy
Hoạt tắnh enzym ngoại bào (D-d, mm) Chủng
Xenlulaza Amylaza Proteaza
HT18đ 0 5 8
NV8T 7 17 7
Ghi chú: D = ựường kắnh vòng phân giải, d = ựường kắnh lỗ ựục trên thạch
Kết quả ở bảng 17 cho thấy cả hai chủng HT18đ và NV8T ựều có hoạt tắnh với 3 enzym ngoại bào. Riêng chủng NV8T có hoạt tắnh enzym ngoại bào khá tốt với khả năng phân giải ựược Amylaza với ựường kắnh vòng phân giải tương ựối cao.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 45
KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu ựược, chúng tôi ựưa ra một số kết luận sau:
1. Từ các bộ phận của mẫu cây thông, chúng tôi ựã phân lập ựược 20 chủng NNS và lựa chọn ựược 2 chủng kắ hiệu là HT18đ và NV8T có hoạt tắnh kháng VSVKđ cao.
2. đã lựa chọn ựược các ựiều kiện lên men thắch hợp cho hoạt tắnh kháng VSVKđ và thu nhận sinh khối khô cao nhất của 2 chủng này là:
Môi trường khoai tây với nguồn cacbon là glucoza cho chủng HT18đ và sacaroza cho chủng NV8T; nguồn nitơ là cao nấm men cho chủng HT18đ và NH4NO3 cho chủng NV8T; pH = 6; thời gian thu nhận sản phẩm thắch hợp là sau 2 tuần lên men.
3. đã tiến hành tách chiết hóa học và xác ựịnh hoạt tắnh sinh học 2 chủng:
Ớ Cặn chiết EtOAc của chủng HT18đ có hoạt tắnh kháng vi khuẩn
B.subtilis, E.coli, S aureus và nấm mốc A.niger với giá trị MIC tương ứng là 100ộg/ml; có biểu hiện hoạt tắnh gây ựộc tế bào trên cả hai dòng tế bào ung thư thử nghiệm là dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và dòng tế bào ung thư phổi Ờ LU; có hoạt tắnh chống oxy hóa trên hệ DPPH với giá trị SC% là 78,95; có khả năng sinh enzym ngoại bào amylaza và proteaza.
Ớ Cặn chiết EtOAc của chủng NV8T có hoạt tắnh kháng nấm men
C.albicans với các giá trị MIC là 100 ộg/ml; không biểu hiện hoạt tắnh gây ựộc trên hai dòng tế bào ung thư thử nghiệm là dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và dòng tế bào ung thư phổi Ờ LU; có hoạt tắnh chống oxy hóa trên hệ DPPH với giá trị SC% là 59,06; có khả năng sinh 3 enzym ngoại bào amylaza, proteaza và xenlulaza.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 46 PHỤ LỤC Hình phụ lục 1. Một số chủng NNS a) b) Hình phụ lục 2. Hoạt tắnh kháng VSVKđ của chủng HT18đ (2) và NV8T (1) a) Kháng với chủng vi khuẩn Bacillus subtillis ATCC 27212
b) Kháng với vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922
Hình phụ lục 3. Chủng HT18 đ kháng với vi khuẩn Staphylococcus aureus
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 47
a) Hoạt tắnh enzym xenlulaza b) Hoạt tắnh enzym proteaza
c) Hoạt tắnh enzym amylaza
Hình phụ lục 4. Hoạt tắnh enzym ngoại bào của 2 chủng HT18đ (2) và NV8T (1)
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Lân Dũng (2002), ỘCông nghệ nuôi trồng nấmỢ, tập 2, nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.
2. Nguyễn Hồng Hà & cộng tác viên, 2000. điều tra ựánh giá hiện tượng của hệ nấm cộng sinh và nhóm vi sinh vật ựối kháng ở cây dược liệu quý và ựịnh hướng ứng dụng. Kết quả thực hiện ựề tài cấp nhà nước ựiều tra cơ bản về tài nguyên môi trường.
3. Nguyễn Sỹ Giao & cộng tác viên, 1971. Nghiên cứu ựịnh hướng ứng dụng một số chủng nấm cộng sinh trong môi trường cây non phục vụ nghề rừng. 4. Phạm Văn Ty, đào Huyền Lương, Nguyễn Thanh Hiền, 1993. ỘTìm hiểu khả năng diệt nấm gây bệnh thối cổ rễ của một số chủng Trichoderma phân lập ở Việt NamỢ. Tr.111, tập 15- số 4 tạp chắ Sinh học.
5. Lê Thị Xuân, Lê Mai Hương, 1997. ỘPhân lập nghiên cứu các chất chiết từ nấm nội kắ sinh trong cây Taxus chinensisỢ Kỷ yếu Ờ Annual report. 6. Lê Mai Hương, Lê Minh Hà, Trần Thị Như Hằng, Trần Thị Hồng Hà, Mai
Ngọc Toàn (2005), ỘChất có hoạt tắnh kháng khuẩn, kháng nấm từ chủng nấm Aspergillus awamori Nakazawa kắ sinh trên cây sảng Stecularia lameolata cavan (họ Steculaceae)Ợ, Tạp chắ Khoa học và công nghệ, 4A (6A), tr. 132-136.
7. Lê Mai Hương, Trần Thị Như Hằng và cộng sự (2010), Ộđiều tra, ựánh giá các chất hoạt tắnh sinh học có giá trị thực tiễn cao từ khu hệ nấm cộng sinh và kắ sinh trên một số cây thuốc bằng mô hình nghiên cứu tiên tiến, ựề xuất giải pháp khai thác và sử dụng hợp lýỢ.
B. TÀI LIỆU TIẾNG ANH
8. Battle Ờ Vierra and L.pezer-Viicente. A study of endophytics fungal special associate with root necrosis of banana in banana and plantain plantation in Cuba.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 49 9. Brady, S.F., and J. Clardy. 2000. CR 377, a new pentaketide antifungal
agent isolated from endophytic fungus. J. Nat. Prod. 63:1447-1448.
10.Clay, K, Hardy, T.N. and Hammond Jr., A.M (1985a). Fungal of Cyperus and their effect on the isact herbivore. American juarnal of Botany
72Ợ1284-1289.
11. Demain, A. L 1981. industrial microbiology. Science 214: 987-994.
12.Gary Strobel, A. Stierl and G.M. Van kijk 1993 PlanScience, Vol-84, 1992, pps. 65-74.
13.Gary A. Strobel and Jia- Yao Li, 1996 Proceeding of UNESCO Regional Symposium on Drug Development fro, Medicial. Plants, Otc. 25-27, 1996. Hary zhow, China, ppa.41-42.
14. Glienke Ờ Blanco, C.199. Guiganrdia citricarpa, Sao Paulo, Brazin. 15. Guo, B., J. Dai, S. Ng, Y. Huang, C. Leong, W. Ong, and B. K. Carte.
2000. Cytonic acids A and B: novel tridepside inhibitors of HCMV protease from the endophytic fungus Cytonaema species. J. Nat. Prod. 63:602-604.
16. Johnson & ctv, 1992. Mango stem and rot pathogens: fruit infection by endophytic colonization of the infloresence and pedic el 120:225-234. 17. Kinder, D., Breen, J.P. and Springer, T. (1990). Russian wheat aphid
resistance in coll-season grasse. Journal of ecolomic entomoplogy 83:685- 692.
18.Loyo, A.C (1995). Transformation variability detectada for RAPD and isolation of endophytic Collectricum musae University of Sao Paulo, Brazil.
19.Lee, J., E. lobkovsky, N. B. Pliam, G. A. Strobel, and J. C. Clardy. 1996. Torreyanic acid: a selectively cytotoxic quinone dimer from endophytic fungus Pestalotiopsis microspora, J. Org. Chem. 61: 3232-3233.
20. Li, C., R. P. Johnson, and J.A. Porco. 2003. Total synthesis of the quinine epoxide dimer (+)- torreyanic acid: application of a biomimetic
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 50 oxidation/electrocyclization/Diels- Alder dimeization cascade. J. Am. Chem. Soc. 125: 5059-5106.
21. Li, J.Y., G.A. Strobel, R. Sidhu, W.M. Hess, and E. Ford. 1996. Endophytic taxol producing fungi from Bald Cypress Taxodium distichum. Microbiology 142: 2223-2226.
22.Medeiros, S.A.F (1998). Micoflora da Folhagenm do cajuerio, Anacardium occidentale L.e controle biological do agente da antracnose, Collectotrichum gloeosporioides (Penz) Sacc. Invitro. Ms. Thesis. Universidade Federal Rural de Pernambuco, Pecife, pernambuco, Brazil. 106p
23.Miller, R.V., C.M. Miller, D.Garton Ờ Kinney, B. Redgrave, J. Sears, M. Condron, D. Teplow, and G. A. Strobel. 1998. Ecomycins, unique antimycotics from Pseudomonas viridiflava. J. Appl. Microbiol. 84:937- 944.
24.Pereira, J.O, Carneiro- Vieira, M.L and Azavedo, J.L (1999). Endophytic fungi from Musa Acuminata and their rentroduction in to axenic plants.
World Journal of Microbiology and Biotechnology 15:37-40.
25. Pereira, J.O, Azavedo, J.L Petrini, 1993. Endophytic fungi of Stylosanthe: A first report. Micologia. 85:362-387.
26.Polishook, 1993.
27.Schiff, P.B., and S.B. Horowitz. 1980. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1561-1565.
28.Shrestha, K., G. A. Strobel, S. Prakash, and M. Gewali. 2001. Evidence for paclitaxelfrom three new endophytic fungi of Himalayan yew of Nepal. Planta Med. 67: 374-376.
29.Seo, Yeong-Su, Hyuk-woo Shin, Sung-Hwan Yun, Jin- Choel Kim and Yin-Won Lee, 1994. Isolation and Characterization of an Anbiotic Substance, FST-01, produced by Fusarium BYA-1 Isolate.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 51 30.Stinson, M., D. Ezra, and G. Strobel.2003. An endophytic Gliocladium sp. of Eucryphia cordifolia producing selective volatile antimicrobial compounds. Plant Sci 165:913-922.
31.Strobel, G.A. 2002. Microbial gifts from rain forest. Can. J. Plant Pathol. 24:14-20.
32.Strobel, G.A., A. Syierle, D. Stierle, and W.M. Hess. 1993. Taxomyces andreanae a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific yew. Mycotaxon 47:71-78.
33.Strobel, G.A., E. Dirksie, J. Sears and C. Markworth. 2001. Volatile antimicrobials from a novel endophytic fungus. Microbiology 147:2943- 2950.
34.Strobel, G.A., E. Ford, J. Worapong, J. K. Harper, A. M. Arif. D. M. Grant, P. C. W. Fung and K. Chan. 2002. Ispoestacin, an izobenzofuranone from Pestslotiopsis microspora, possessting antifungal and antioxidant activities. Phytochemistry 60:179-183.
35.Strobel, G., X. Yang, J. Sears, R. Kramer, R. S. Sidhu and W. M. Hess. 1996. Taxol from Pestalotiopsis microspora, an endophytic fungus of
Taxus williichiana. Microbiology 142:435-440.
36.Viret and Petrini, 1994 Colonization of beech leaves (Fagus sylvatica) by the endophytes.
37. Webber, J. (1981) A natural control of dutch elm disease, London 292:449-451.
38.Walsh, T.A. 1992. Inhibitors of o-glucan synthesis, p. 349-373. In J.A Sutcliffeband N.H Georgopapadakou (ed.), Emerging targets in antibacterial and antifungal chemotherapy. Chapman & hall, London, United Kingdom.
39.Worapong, J., G.A. Strobel, B. Daisy, u. Castillo, G. Baird and W.M. Hess (2002). Muscodor albus gen. et sp. nov., an endophyte from Grevillea pteridifolia, Mycotaxon 81:463-475.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 52 40.Worapong, J., G.A. Strobel, E.J. Ford , J.Y. Li, G. Baird and W. M.Hess (2001). Muscodor albus gen. et sp. nov., an endophyte from Cinnamomum zeylanicum. Mycotaxon 79:67-79.
41.Williamson, B, 1994 Latencyand quiesences insurvival and sucess of fungal plant pathogens. Oxford.
42.Zou, W. X., J. C. Meng, H. Lu, G. X. Chen, G.X. Shi, T.Y. Zhang and R.X. Tan. 2000. Metab olites of Collectrichum gloeosprioides, an endophytic fungus in Artemisia mongolica. J. nat. Prod.63:1529-1530.