2.2.1. Phân lập các chủng nấm nội sinh Lấy mẫu
Mẫu còn tươi ựược giữ nguyên vẹn trong túi nilon sạch, bảo quản ở nhiệt ựộ 4oC trước khi phân lập.
Làm sạch bề mặt mẫu
Rửa mẫu dưới vòi nước chảy trong 5 phút. Khi bề mặt mẫu ựã ráo nước, ngâm mẫu trong cồn EtOH 70o trong 1 phút. để mẫu khô ráo trong tủ cấy vô trùng
Phân lập
Dùng dụng cụ vô trùng cắt mẫu thành những ựoạn nhỏ dài 5-10 mm; ựặt các mảnh nhỏ lên ựĩa petri có môi trường phân lập, sau ựó chuyển ựĩa vào tủ ấm 30ỨC.
Lựa chọn và lưu giữ chủng giống
Khi nấm bắt ựầu có sợi khuẩn ty mọc ra từ mô cây, chọn ra các chủng nấm và ria cấy trên môi trường Martin ựể tinh sạch chủng. Lựa chọn các chủng sạch và cấy trên môi trường thạch nghiêng khoai tây ựể lưu giữ giống và kiểm tra hoạt tắnh. Trước khi mang ra sử dụng cấy truyền lại sang ống nghiệm mới ựể làm mới chủng.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 22
2.2.2. Sàng lọc hoạt tắnh kháng vi sinh vật kiểm ựịnh của các chủng nấm nội sinh phân lập ựược
Chuẩn bị
Các chủng VSVKđ ựược cấy truyền từ ống thạch nghiêng sang môi trường canh thang ựể làm mới chủng, ựặt trong tủ ấm 30ỨC (ựối với nấm); 37ỨC (ựối với vi khuẩn) thời gian 48h.
đun MT cho thạch tan hết, ựể nguội ựến 40ỨC
Dùng Micro pipet hút dịch sinh khối VSVKđ ra ựĩa petri, sau ựó hòa ựều với thạch (ựã ựể nguội ựến 50ỨC), theo tỷ lệ 5%. Trong ựó nấm kiểm ựịnh hòa với môi trường Sabouraud, còn vi khuẩn kiểm ựịnh hòa với môi trường thạch thường.
a) Phương pháp thỏi thạch (xác ựịnh hoạt tắnh kháng sinh trong khuẩn ty)
Dùng khoan ựục lấy thỏi thạch có chứa khuẩn ty ựặt vào ựĩa petri ựã cấy VSVKđ, ựể trong tủ lạnh 4 ọ 5h cho chất kháng sinh khuyếch tán vào MT thạch. Sau ựó ựặt vào tủ ấm 30ồC ựối với nấm và ựọc kết quả sau 48h; vi khuẩn nuôi ở 37ỨC trong 24h thì lấy ra ựọc kết quả. Hoạt tắnh kháng VSVKđ ựược xác ựịnh theo ựường kắnh vòng vô khuẩn (D-d, mm); trong ựó D là ựường kắnh vòng vô khuẩn, d là ựường kắnh thỏi thạch.
b) Phương pháp ựục lỗ thạch (xác ựịnh hoạt tắnh kháng sinh trong môi trường dịch thể)
Dùng khoan ựục lỗ trên MT thạch ựã cấy VSVKđ trong ựĩa petri. Nhỏ vào các lỗ khoan dịch nuôi cấy hoặc dịch chiết ựã lọc qua giấy lọc. Các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp thỏi thạch.
2.2.3. Xác ựịnh trọng lượng sinh khối khô
Giấy lọc ựược sấy ở 90ỨC ựến trọng lượng không ựổi. Cân nhanh trên cân ựiện tử. Sau ựó lọc dịch nuôi thu lấy tế bào. đưa giấy lọc cộng sinh khối VSV sấy khô ở 90ỨC ựến trọng lượng không ựổi. Sinh khối VSV ựược xác ựịnh theo công thức: P = P1 Ờ P2
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 23 Trong ựó P1 là khối lượng giấy lọc và sinh khối VSV.
P2 là khối lượng giấy lọc.
2.2.4. Hoạt tắnh enzym ngoại bào
Khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng nấm ựược xác ựịnh theo phương pháp ựục lỗ thạch.
2.2.4.1. Xác ựịnh xenlulaza
Cơ chất ựể thử hoạt tắnh xenlulaza là CMC.
Tiến hành: đun nóng MT cho thạch và cơ chất tan hết, ựể nguội 50- 60oC thì ựổ ra ựĩa Petri. Khi thạch ựông thì khoan lỗ thạch, sau ựó nhỏ phần dịch nuôi vào giếng thạch. để trong tủ lạnh 4oC khoảng 5 tiếng ựể enzym khuyếch tán, sau ựó ựặt vào tủ ấm 30oC khoảng 24 giờ. Nhỏ thuốc thử lugol, nếu dịch nuôi có hoạt tắnh xenlulaza thì sẽ thấy xuất hiện vòng phân giải không bắt màu trên ựĩa thạch. Hiệu số giữa ựường kắnh vòng phân giải và ựường kắnh lỗ ựục (D-d, mm) phản ánh hoạt tắnh xenlulaza của dịch nuôi.
2.2.4.2. Xác ựịnh amilaza
Cơ chất ựể thử hoạt tắnh amilaza là tinh bột. Các bước tiến hành tương tự như khi thử hoạt tắnh xenlulaza, sử dụng thuốc thử lugol.
2.2.4.3. Xác ựịnh proteaza
Cơ chất ựể thử là gelatin. Sử dụng thuốc thử là dung dịch axit axetic 0,3%. Các bước tiến hành tương tự như khi xác ựịnh enzym xenlulaza và amilaza.
2.2.5. Ảnh hưởng của ựiều kiện nuôi cấy ựến hoạt tắnh sinh học của các chủng nấm các chủng nấm
2.2.5.1. Lựa chọn môi trường thắch hợp
Các chủng nấm ựã lựa chọn ựược nuôi cấy trên các MT dịch thể: Sabouraud, Khoai tây, nước chiết Cám, nước chiết Ngô, nước chiết đậu tương, Czapek. Sau thời gian 2 - 3 tuần tiến hành xác ựịnh hoạt tắnh sinh học và trọng lượng sinh khối khô ựể lựa chọn ra môi trường thắch hợp.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 24
2.2.5.2. Ảnh hưởng của pH ban ựầu
Nấm ựược nuôi cấy trên MT khoai tây dịch thể, chỉnh pH theo các thang 3; 4; 5; 6; 7; 8 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N. Sau 2 - 3 tuần xác ựịnh hoạt tắnh sinh học bằng phương pháp ựục lỗ thạch và trọng lượng sinh khối khô.
2.2.5.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Nấm ựược nuôi cấy trên MT khoai tây dịch thể, theo các mốc thời gian 1 tuần; 2 tuần; 3 tuần; 4 tuần ; 5tuần. Ở mỗi thời ựiểm xác ựịnh hoạt tắnh sinh học bằng phương pháp ựục lỗ thạch và trọng lượng sinh khối khô.
2.2.5.4. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon và nitơ ♦ Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Sử dụng MT Czapek, nguồn cacbon ựược thay bằng: Glucoza, Lactoza, Saccaroza, Tinh bột, CMC với lượng không ựổi.
♦ Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Sử dụng MT Czapek, nguồn nitơ ựược thay bằng: pepton, cao nấm men, (NH4)2SO4, NaNO3, NH4NO3.
2.2.6. Lên men, chiết rút các thành phần có hoạt tắnh sinh học của 2 chủng nấm nội sinh chủng nấm nội sinh
Các chủng nấm có hoạt tắnh ựược nuôi cấy trên MT dịch thể trong 2- 3 tuần. Sau ựó sẽ tách chiết theo sơ ựồ 1. Sản phẩm là cặn chiết EtOAc sẽ dùng ựể ựánh giá hoạt tắnh sinh học.
Phương pháp chiết rút thành phần có hoạt tắnh sinh học ựược thể hiện bằng sơ ựồ sau:
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 25 Sơ ựồ 1: Phương pháp chiết rút các chế phẩm có hoạt tắnh sinh học
2.2.7. Xác ựịnh hoạt tắnh sinh học của các cặn chiết 2.2.7.1. Hoạt tắnh kháng vi sinh vật kiểm ựịnh 2.2.7.1. Hoạt tắnh kháng vi sinh vật kiểm ựịnh
Việc ựánh giá hoạt tắnh kháng VSVKđ ựược thực hiện theo phương pháp của Vanden Bergher và Vlietinck (năm 1994). đó là phương pháp tiến hành trên phiến vi lượng 96 giếng ựể tìm ra nồng ựộ ức chế tối thiểu MIC của các chất có hoạt tắnh.[29]
Kháng sinh kiểm ựịnh bao gồm: Ampicillin ựối với vi khuẩn Gram (+); Tetraxilin ựối với vi khuẩn Gram (-); Nystatin dối với nấm mốc và nấm men. VSVt kiểm ựịnh gồm 8 chủng ựã nêu ở trên.
Mẫu thử ựược hòa tan bằng dung môi DMSO 100%; với từ 4 ọ 10 thang nồng ựộ ựược pha loãng dần từ dịch gốc rồi nhỏ sang phiến vi lượng. VSVKđ sau khi ựược hoạt hóa sẽ ựược pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng ựộ tương ựương 0,5 ựơn vị McLand (khoảng 108 VSV trên ml). để trong tủ ấm 37ỨC trong 24h ựối với vi khuẩn và 30ỨC trong 48h ựối với nấm. Sau ựó ựọc kết quả và tắnh giá trị ức chế tối thiểu (MIC).
Nếu mẫu thô có MIC ≤ 200 ộg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50 ộg/ml là có hoạt tắnh. Dịch nuôi nấm (2-3 tuần) Cặn chiết EtOAc Thử hoạt tắnh Dịch chiết EtOAc
Chiết với EtOAc (1:1) 3 lần
Loại dung môi dưới áp suất giảm
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 26
2.2.7.2. Hoạt tắnh gây ựộc tế bào
Theo phương pháp của Likhiwitayawuid ựang ựược tiến hành tại viện nghiên cứu quốc gia của Mỹ (NCI).
Dòng tế bào: Dòng LU (Lung cancer Ờ ung thư phổi); dòng HepỜG2 (Hepatocellular carcinoma - ung thư gan) từ Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương.
Tế bào ung thư ựược duy trì liên tục ở các ựiều kiện tiêu chuẩn. Sau khi tế bào ựược hoạt hóa phát triển ựến pha log sẽ ựược sử dụng cho thử test với các chất thử ựã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng ựộ khác nhau, lặp lại 3 lần trên phiến vi lượng 96 giếng. Phiến thử nghiệm bao gồm: tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử, ựược ủ trong tủ ấm CO2/37 ỨC /48ọ72h ựể tế bào tiếp tục phát triển. Sau ựó phiến ựược lấy ra cố ựịnh tế bào, rửa, nhuộm, loại thuốc nhuộm thừa và hòa lại bằng dung dịch chuẩn.
đọc kết quả trên máy ựọc Elisa bước sóng 495 ọ 515 nm.
Giá trị IC50 ựược tắnh trên chương trình Table curve với giá trị logarit dựa trên giá trị dãy các thang nồng ựộ khác nhau của chất thử và giá trị OD ựo ựược.
Mẫu thô có IC50 ≤ 20 ộg/ml; mẫu tinh có IC50 ≤ 5 ộg/ml là có hoạt tắnh.
2.2.7.3. Hoạt tắnh chống oxy hóa
Phản ứng ựược tiến hành theo phương pháp của Shela G., Olga, M. B., Elena, K., và cộng sự (2003).
Dựa trên nguyên tắc 1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường ựộ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tắnh chống oxy hoá ựược ựánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thắ nghiệm so với ựối chứng khi ựọc trên máy Elisa ở bước sóng 495 ọ 515 nm.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm nội sinh
Từ các bộ phận thân, cành, lá, rễ của các mẫu thông thu thập ựược, chúng tôi ựã phân lập ựược 20 chủng NNS. Các ựặc ựiểm, hình thái và màu sắc khuẩn lạc của các chủng nấm ựược trình bày ở bảng 1 dưới ựây.
Bảng 1: Các chủng phân lập ựược từ cây thông
STT KH chủng Bộ phận phân lập Màu sắc khuẩn lạc Sắc tố sinh ra môi trường Mặt sau thạch 1 05T Thân Trắng đỏ đỏ 2 05C Cành Trắng đen đen
3 EH6R Rễ Xanh Không Be
4 EH12C Cành Trắng đen đen
5 EH12T Thân Vàng ựen Vàng Vàng ựen
6 EH13T Thân Xanh lá cây Nâu Trắng
7 EH18C Cành Xanh rêu Vàng Trắng
8 HT7đ Rễ Xanh xám Không đen
9 HT18đ Rễ Trắng xanh Không Be
10 KN8L Lá Trắng Không đen
11 KN10T Thân Nâu Không đen
12 KN13L Lá Trắng Vàng nhạt Trắng
13 KN13T Thân Nâu trắng Không đen
14 KN14T Thân Xám đen Vàng nhạt
15 KN15L Lá Xám Nâu đen
16 NV8C Cành Trắng Vàng Be
17 NV8T Thân Vàng Không đen
18 NV10T Thân Trắng xám Không Trắng/tắm
19 XT3L Lá Trắng ựen Không đen
20 XT3R Rễ Trắng xám Không Trắng
Có thể thấy các chủng nấm phân lập ựược khá ựa dạng về hình thái và màu sắc. Màu sắc khuẩn lạc có thể thay ựổi từ trắng, vàng, ựến ựen; sắc tố tiết ra cũng thay ựổi từ sắc tố màu trắng, màu vàng, màu xanh, màu ựenẦ
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 28
3.2. Sàng lọc sơ bộ các chủng có hoạt tắnh sinh học
NNS trong quá trình sống có thể tạo ra chất giúp thực vật chủ ựề kháng tốt hơn với ựiều kiện ngoại cảnh bất lợi, ựặc biệt là sâu hại và mầm bệnh. Vì vậy chúng tôi xác ựịnh sàng lọc, tuyển chọn từ các chủng nấm phân lập ựược theo hướng hoạt tắnh sinh học.
Từ 20 chủng NNS ựã phân lập ựược, chúng tôi tiến hành sàng lọc, tuyển chọn những chủng có hoạt tắnh sinh học tốt nhất. Quá trình sàng lọc hoạt tắnh kháng VSVKđ ựược tiến hành theo hai bước:
Bước một, 20 chủng NNS ựược sàng lọc hoạt tắnh kháng VSVKđ theo phương pháp thỏi thạch ựể tuyển chọn ra những chủng có hoạt tắnh kháng VSVKđ cao. Kết quả ựược trình bày ở bảng 2.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 29
Bảng 2. Hoạt tắnh sơ bộ của các chủng NNS phân lập ựược
Hoạt tắnh kháng VSVKđ (D-d,mm) STT KH chủng B. subtilis E. coli P. aeruginosa S. aureus S. cerevisiae A. niger F. oxysporum C. albicans 1 05T - - - - - - - - 2 05C - - - - - - - - 3 EH6R 8 10 - - - 14 - 5 4 EH12C - 9 - - - - - - 5 EH12T - - - - - - - - 6 EH13T - - - - - - - - 7 EH18C - - - - - - - - 8 HT7đ 6 7 - - - - - - 9 HT18đ 16 10 - 18 - 5 12 7 10 KN8L - - - - - - - - 11 KN10T - - - - - - - - 12 KN13L - - - - - - - - 13 KN13T 8 11 - - - - - - 14 KN14T - - - - - - - - 15 KN15L - - - - - - 5 - 16 NV8C - - - - - - - - 17 NV8T 9 12 - 15 - - 11 8 18 NV10T - - - - - - - - 19 XT3L 16 20 - - - - 15 13 20 XT3R 11 7 - - - 6 8 -
Ghi chú: D = ựường kắnh vòng vô khuẩn, d = ựường kắnh lỗ ựục trên thạch ựĩa
Dựa vào kết quả bảng 2 cho thấy, trong số 20 chủng nấm có 12 chủng không thể hiện hoạt tắnh kháng VSVKđ; có 3 chủng có hoạt tắnh kháng 2 VSVKđ; 5 chủng (HT18đ, NV8T, XT3R, XT3L, EH6R) có hoạt tắnh kháng từ 3 VSVKđ trở lên. Vì vậy chúng tôi chọn 5 chủng này tiếp tục ựược sàng lọc trong bước thứ hai.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 30 Bước hai, 5 chủng nấm sàng lọc sau bước một ựược lên men trên MT khoai tây dịch thể trong thời gian 2 tuần. Hoạt tắnh kháng VSVKđ ựược xác ựịnh bằng phương pháp ựục lỗ thạch. Kết quả ựược trình bày trong bảng 3.
Bảng 3. Hoạt tắnh kháng VSVKđ của các chủng NNS ựược lựa chọn
Hoạt tắnh kháng VSVKđ (D-d, mm) STT KH chủng B. subtilis E. coli S. aureus A. niger S. cerevisiae F. oxysporum C. albicans 1 EH6R 8 5 0 0 0 0 3 2 HT18đ 14 9 16 5 6 16 5 3 NV8T 7 10 14 0 0 10 7 4 XT3L 0 6 0 0 0 0 0 5 XT3R 5 0 0 0 0 3 0
Ghi chú: D = ựường kắnh vòng vô khuẩn, d = ựường kắnh lỗ ựục trên thạch ựĩa
Kết quả sàng lọc bước thứ hai cho thấy, trong số 5 chủng thử hoạt tắnh kháng VSVKđ có hai chủng HT18đ và NV8T có hoạt tắnh kháng VSV rất mạnh (kháng 5 loại VSVKđ) với ựường kắnh vòng vô khuẩn lớn. Các chủng còn lại có hoạt tắnh kháng các VSVKđ yếu.
Như vậy sau hai bước sàng lọc chúng tôi lựa chọn ựược hai chủng có hoạt tắnh kháng VSVKđ tốt nhất là các chủng HT18đ và NV8T. Cả hai chủng này ựược dùng ựể nghiên cứu sâu hơn về các ựặc ựiểm nuôi cấy và hoạt tắnh sinh học.
3.3. Các ựiều kiện nuôi thắch hợp cho hoạt tắnh kháng vi sinh vật kiểm ựịnh và sinh khối khô của hai chủng nấm HT18đ và NV8T
3.3.1. Môi trường nuôi thắch hợp
Hai chủng HT18đ và NV8T ựược nuôi cấy trên 6 loại MT dịch thể: Khoai tây, Sabouraud, nước chiết Cám, nước chiết Ngô, nước chiết đậu tương và Czapek. Sau 2 tuần nuôi cấy xác ựịnh trọng lượng sinh khối khô. Kết quả sinh khối khô của hai chủng nấm HT18đ và NV8T trên 6 loại MT ựược thể hiện trong bảng 4 và hình 2.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 31
Bảng 4: Khối lượng sinh khối khô của hai chủng HT18đ và NV8T.
Sinh khối khô (g/l) STT Chủng
Khoai tây Sb Cám Ngô Czapek đậu tương
1 HT18đ 8,025 6,645 5,143 5,576 2,046 6,183 2 NV8T 5,954 3,505 5,202 4,238 5,208 4,770 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Kho ai tâ y Sabo ura ud Cza pek VSV kiểm ựịnh K h ố i lư ợ n g ( g /l ) HT18đ NV8T
Hình 2: Khối lượng (g/l) sinh khối khô của hai chủng HT18đ và NV8T
đồng thời với việc xác ựịnh trọng lượng sinh khối khô, chúng tôi cũng xác ựịnh hoạt tắnh kháng VSVKđ của hai chủng này trên các MT khác nhau theo phương pháp ựục lỗ thạch. Kết quả thử hoạt tắnh kháng VSVKđ ựược trình bày trong bảng 5 và hình 3, 4.
Dương Thị Thanh Thủy Lớp 06-05 32
Bảng 5. Hoạt tắnh kháng VSVKđ của 2 chủng NNS trên các môi trường khác nhau Hoạt tắnh kháng VSVKđ (D-d,mm) KH chủng Môi trường B. subtilis E. coli S. aureus A. niger C. albicans F. oxysporum Khoai tây 15 13 11 7 5 10 Sabouraud 10 12 4 0 4 9 Cám gạo 9 8 7 0 7 0 Bột ngô 7 6 0 0 5 0 Czapek 7 0 0 5 0 5 HT18đ đậu tương 10 8 0 0 6 0 Khoai tây 9 12 10 5 7 9 Sabouraud 7 6 7 0 0 8 Cám gạo 0 9 8 0 7 5 Bột ngô 0 0 8 5 0 0 Czapek 8 7 10 6 6 6 NV8T đậu tương 6 5 0 7 0 5
Ghi chú: D = ựường kắnh vòng vô khuẩn, d = ựường kắnh lỗ ựục trên thạch ựĩa