B ảng 3.1 Danh sách giống lúa Số thứ
4.3.Kết quả cắt bằng enzyme Hinf
Hình 4.8: Kết quả cắt bằng enzyme HinfI của 15 giống lúa (1 – 15)
(M: thang)
Giếng 1: OMCS2000 (ĐCA1) (đồng hợp nhiễm); Giếng 2: OM6561-12 (Ao) (đồng hợp nhiễm); Giếng 3: OM4218 (A1) (đồng hợp nhiễm); Giếng 4: OM5199 (A1) (đồng hợp nhiễm); Giếng 5: OM4495 (ĐC) (đồng hợp kháng); Giếng 6: OM5199-2 (dị hợp tử); Giếng 7: OMCS2000 (đồng hợp nhiễm); Giếng 8: OM4498 (đồng hợp nhiễm); Giếng 9: OM2395 (đồng hợp nhiễm); Giếng 10: OM5930 (đồng hợp nhiễm); Giếng 11: OM4900 (đồng hợp nhiễm); Giếng 12: OM5239 (A2) (đồng hợp nhiễm); Giếng 13: OM5637 (A2) (dị hợp tử); Giếng 14: AS996 (dị hợp tử); Giếng 15: OM4088 (đồng hợp nhiễm).
1000 bp 500 bp
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M
Hình 4.9. Kết quả cắt bằng enzyme HinfI của 15 giống lúa (16 – 30)
(M: thang) Giếng 16: 504/66 (đồng hợp nhiễm); Giếng 17: 547/74 (đồng hợp nhiễm); Giếng 18: 466/53 (đồng hợp nhiễm); Giếng 19: MTL604 (đồng hợp nhiễm); Giếng 20: 567/7/1 (ĐC) (đồng hợp kháng); Giếng 21: MTL589 (đồng hợp nhiễm); Giếng 22: 542/4/3 (đồng hợp nhiễm); Giếng 23: MTL555-8 (đồng hợp nhiễm); Giếng 24: TRẮNG LÙN (đồng hợp nhiễm); Giếng 25: IR50404 (đồng hợp kháng); Giếng 26: OM3526 (đồng hợp kháng); Giếng 27: MTL560 (dị hợp tử); Giếng 28: MTL500 (đồng hợp kháng); Giếng 29: MTL499 (đồng hợp nhiễm); Giếng 30: TRẮNG TÉP (đồng hợp nhiễm). Sau khi cắt sản phẩm PCR với enzyme HinfI ta thấy xuất hiện sự đa hình của các giống lúa. Theo Lang (1999) thì:
Các giống có 3 vạch là các giống đồng hợp tử kháng (Hình 4.8 và Hình 4.9): Giếng số 5, 20, 25, 26, và 28. Các giống có 2 vạch là các giống đồng hợp tử nhiễm (Hình 4.8 và Hình 4.9): Giếng số 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23 , 24, và 29, 30. 1000 bp 500 bp
Các giống có 4 vạch là các giống dị hợp tử mang gen kháng (Hình 4.8): Giếng số 6, 13, 14, 27.
Theo Lang (1999) sau khi khuếch đại DNA của các giống lúa với cặp mồi RG457FL/RL, kiểm tra trên gel xuất hiện các vạch có kích thước từ 750 – 800 bp. Sau khi cắt với enzyme, kiểu gen kháng có kích thước 300, 250, 200 bp. Kiểu gen nhiễm có kích thước là 500, 200 bp. Tuy nhiên, kết quả kiểm tra lại cho thấy kiểu gen kháng có kích thước là 350, 250, 200 bp. Kiểu gen nhiễm có kích thước là 600, 200 bp. Kết quả không khác biệt về số lượng vạch giữa các giống lúa mang kiểu gen nhiễm và kháng rầy. Đồng thời kết quả này cũng phù hợp với kết quả của phản ứng PCR. Về mặt lý thuyết, enzyme HinfI khi gặp trình tự G/ANTC trên DNA của lúa sẽ tiến hành cắt ngay vị trí nhận biết này. Đối với những giống mang gen kháng rầy sẽ có hai vị trí cắt, giống mang gen nhiễm rầy có một vị trí cắt. Còn những giống dị hợp mang gen kháng sẽ có ba vị trí cắt.
CHƯƠNG 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Trong quá trình nghiên cứu tính kháng rầy nâu trên 30 giống lúa ta đã tìm được:
Năm giống đồng hợp kháng rầy nâu: OM4495, 567/7/1 (ĐC), IR50404, OM3526 và MTL500.
Bốn giống dị hợp mang gen kháng rầy nâu: OM5199-2, OM5637 (A2), AS996, MTL560.
Hai mươi mốt giống đồng hợp tử nhiễm rầy nâu: OMCS2000 (ĐCA1), OM6561-12 (A0), OM4218 (A1), OM5199 (A1), OMCS2000, OM4498, OM2395, OM5930, OM4900, OM5239 (A2), OM4088, 504/66, 547/74, 466/53, MTL604, MTL589, 542/4/3, MTL555-8, TRẮNG LÙN, MTL499 và TRẮNG TÉP.
Từ kết quả trên cho thấy đã có sự xuất hiện của gen Bph-10 trên một số giống lúa ở ĐBSCL.
5.2. Đề nghị
Tiếp tục sử dụng dấu phân tử STS nghiên cứu tính kháng rầy nâu trên những giống lúa khác ở ĐBSCL.
Sử dụng phương pháp điện di hai chiều để nghiên cứu tính kháng rầy nâu của 30 giống này.
Bên cạnh đó, ta có thể sử dụng dấu phân tử RM277 để phát hiện gen kháng rầy nâu
Bph-15 định vị trên nhiễm sắc thể số 4; dấu phân tử RFLP để phát hiện gen kháng rầy
Hình Tên hình Trang
2.1 Rầy nâu trưởng thành dạng cánh dài 4 2.2 Rầy nâu trưởng thành dạng cánh ngắn 5
2.3 Ấu trùng của rầy nâu 5
2.4 Trứng rầy nâu 6
2.5 Vòng đời của rầy nâu 6
2.6 Lúa bị bệnh VLLXL 7
2.7 Rầy tập trung ở gốc lúa 7 3.1 Một số thiết bị được dùng trong quá trình trích DNA 22 3.2 Một số thiết bị dùng để kiểm tra DNA 23 3.3 Máy PCR Perkin Elmer 9700 24 3.4 Chu trình nhiệt hiệu chỉnh phản ứng PCR 25 3.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 25 4.1 Kết quả kiểm tra DNA 27 4.2 Kết quả PCR thử nghiệm 28 4.3 Kết quả PCR hiệu chỉnh 29 4.4 Kết quả PCR hiệu chỉnh nồng độ Taq polymerase 29 4.5 Kết quả PCR hiệu chỉnh với các nhiệt độ bắt cặp khác nhau 30 4.6 Kết quả PCR với nhiệt độ bắt cặp 620C 31 4.7 Kết quả PCR với cặp mồi RG457FL/RL 32
Bảng Tên bảng Trang (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1 Danh sách giống lúa 20 3.2 Thành phần hóa chất của phản ứng PCR 24 3.3 Hóa chất dùng để cắt DNA 26
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism, kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn DNA nhân bản chọn lọc
BiH2O Nước cất hai lần bp Base pair, cặp bazơ
CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide cM CentiMorgan
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxyribonocleotide triphosphate ĐBSCL Đồng bằng Sông Cửu Long
EB Extraction buffer
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid
IRRI International Rice Research Institute, Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế M Thang 100 bp
Nu Nucleotide
SSR Simple Sequence Repeat, kỹ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản STS Sequence Tagged Site, kỹ thuật xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu OD Optical density
PCR Polymerase Chain Reaction, phản ứng chuỗi trùng hợp
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA, kỹ thuật đa hình các đoạn DNA khuyếch đại ngẫu nhiên
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms, kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt tới hạn
rpm Round per minute, vòng/phút SDS Sodium dodecyl sulphate TE Tris-EDTA
Nghiên cứu Phát triển Đồng bằng Sông Cửu Long. Các giống này được trồng trong nhà lưới từ một đến hai tuần tuổi. Sau đó lấy lá để trích DNA và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi RG457FL/RL. Với dấu phân tử này mức độ đa hình thể hiện không rõ. Do đó, tiến hành phân cắt giới hạn các sản phẩm PCR bằng enzyme HinfI. Trong 30 giống lúa được nghiên cứu thì có 5 giống đồng hợp tử kháng rầy: OM4495, 567/7/1, IR50404, OM3526 và MTL500; 4 giống dị hợp: OM5199-2, OM5637 (A2), AS996, MTL560 và 22 giống đồng hợp nhiễm. Điều này chứng tỏ có sự xuất hiện của gen
Bph-10 trên một số giống lúa ở ĐBSCL.
Delta Institute were studied to determine the Bph-10 gene (Table 3.1). These varieties were planted in a net house for one to two weeks. Then the rice leaves were cut for extracting DNA. After that the PCR reaction was carried out with the pair of STS primers RG457FL/RL. This molecular marker did not show polymorphism clearly. Therefore, the restriction enzyme HinfI was used to reveal polymorphism. In thirty varieties of rice have been researched, there were five varieties determined Brown plant hopper resistance homozygote namely OM4495, 567/7/1, IR50404, OM3526 and MTL500; and four varieties Brown Plant hopper resistance heterozygote. They were 2- OM5199, OM5637 (A2), AS996, and MTL560. This has approved that there is a presence of gene Bph-10 on some varieties of rice in the Mekong Delta.
Key words: Brown plant hopper, Bph-10 gene, biotype, restriction enzyme, STS marker…
Akagi H., Y. Yokozeki, A. Inagaki and T. Fujimura. 1996. Microsatellite DNA markers for rice chromosomes. Theor. Appl. Genet. 94: 61-67.
Athwal, D. S., M. D. Pathak, E. H. Bacalangco and C. D. Pura. 1971. Genetics of resistance to brown planthoppers and green leafhoppers in Oryza sativa L. Crop Sci. 11: 747-750.
Ikeda, R. and D.A.Vaughan. 2006. The distribution of resistance genesto the brown plant hopper in rice germplasm. International Rice Research Institute, P.O. Box 933, Manila, Philippines.
Jones, P.L., P. Gacesa, and R.K. Butlin. 1996. Systematics of brown planthopper and related species using nuclear and mitochondrial DNA.. In W.O.C. Symondson and J.E. Liddell (ed.) The ecology of agricultural pests. Chapman and Hall, London. pp. 133– 148.
Juneja S., A. Das, S.V. Joshi et al.. 2006. Oryza nivara (Sharma et Shastry) the progenitor of O. sativa (L.) subspecies indica harbours rich genetic diversity as measured by SSR markers. Current science 91: 1079-1085.
Kabir, M.A., and G.S. Khush. 1988. Genetic analysis of resistance to brown planthopper in rice (Oryza sativa L). Plant Breed. 100:54-58.
Kawaguchi, M., K. Murata, T. Ishii, S. Takumi, and N. Mori. 2001. Assignment of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stal) resistance gene bph-4 to the rice
chromosome 6. Breed. Sci. 51:13-19.
Lakshminarayana, A., and G.S. Khush. 1977. New genes for resistance to the brown planthopper in rice. Crop Sci. 17: 97-100.
lugens Stal) Resistance Gene bph4 to the Rice Chromosome 6. Breeding Science 51:
13-18. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nemamoto, H., R. lkeda, and C. Kaneda. 1989. New genes for resistance to brown planthopper, Nilaparvata lugens Stal, in rice. Jpn. J. Breed. 39:23-28.
Nguyen Thi Lang and Bui Chi Buu. 2003. Genetic And Physical Maps Of Gene Bph- 10 Controling Brown Plant Hopper Resistance In Rice (Oryza sativa L.). Omonrice 11: 35-40.
Nguyen Thi Lang and Bui Chi Buu. 2006. Mapping QTLs for phosphorus deficiency tolerance in rice (Oryza sativa L.). Omonrice 14: 1-9.
Pham Thi Mui and Bui Ba Bong. 1999. Evaluation of rice varieties for resistance to brown planthopper in the Mekong Delta. OmonRice 7:1-8.
Trinh Hoan Khai and Nguyen Thi Lang. 2005. Using SSR marker to identify allele variation of somaclonal mutants in indica rice. Omonrice 13: 121-128.
Tiếng Việt:
Bùi Bá Bổng, Nguyễn Văn Huỳnh, Nguyễn Hữu Huân, Hồ Văn Chiến, Ngô Vĩnh Viễn, Mai Thành Phụng, Phạm Văn Dư và Rogelio Cabunagan. 2006. Sổ tay hướng dẫn phòng trừ rầy nâu truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá hại lúa. Trung tâm Khuyến nông Quốc Gia (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn).
Bùi Chí Bửu, K.Reganayaki, A.S Reddy. 1997. Phân tích di truyền tính kháng rầy nâu của giống lúa hoang nhờ marker. NXB Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
Bùi Chí Bửu. 2002. Cơ sở di truyền tính kháng sâu bệnh hại cây trồng. NXB Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang. 2007. Chọn giống cây trồng phương pháp truyền thống và phân tử. NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh.
Đoàn Văn Hậu. 2008. Xác định hai giống lúa nanh chồn và nếp than dựa trên các đặc điểm hình thái, đặc tính nông học và dấu phân tử Microsatellite. 15 – 17 trang.
Lưu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang và Thiếu Văn Đường. 2003. Định vị các gen kháng rầy nâu BPH-4 và BPH-6 trên nhiễm sắc thể lúa. Tạp chí di truyền học và ứng dụng, số 2: 29 – 33.
Nguyễn Đức Khiêm. 2006. Giáo trình Côn Trùng Nông Nghiệp. NXB Nông nghiệp Hà Nội. 99-104 trang.
Nguyễn Ngọc Đệ. 1994. Giáo trình cây lúa. Tủ sách Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Thị Giáng Đan. 2008. Phát hiện gen kháng rầy nâu trên một số giống lúa ở Đồng bằng Sông Cửu Long bằng marker phân tử. 5 – 8 trang.
Nguyễn Thị Lang, Trần Thị Thu Hằng, Phạm Thị Thu Hà, Bùi Thị Dương Khuyền, Phạm Công Thành, Nguyễn Thạch Cân và Bùi Chí Bửu. 2006. Ứng dụng STS (Sequence Tagged Sites) và SSR (Simple Sequence Repeat) marker để đánh giá tính chống chịu rầy nâu trên cây lúa Oryza sativa L. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, số 4: 11-15.
Nguyễn Văn Đĩnh và Trần Thị Liên. 2005. Khảo sát tính kháng rầy nâu Nilaparvata lugens S. của các giống lúa Đồng bằng Sông Hồng và miền núi phía bắc Việt Nam. Hội nghị côn trùng học toàn quốc.
Nguyễn Văn Luật. 2002. Cây lúa Việt Nam thế kỷ 20, NXB Nông nghiệp Hà Nội. Nguyễn Vĩnh Phúc, Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Áp dụng STS và microsatellite marker trong chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá. Omonrice 13: 18-24.
học, Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Xuân Lý. 2005. Khảo nghiệm đặc tính nông học, năng suất, phẩm chất của 15 giống lúa quốc gia A2 tại trại giống Bình Đức – An Giang vụ đông xuân 2004 – 2005, 3 trang.
Trịnh Đình Đạt. 2006. Công Nghệ Sinh Học, tập 4. NXB Giáo dục.
Võ Thị Hương Lan. 2006. Giáo Trình Sinh Học Phân Tử Tế Bào Và Ứng Dụng. NXB Giáo dục.
Trang Web:
http://www.clrri.org/rice/var/raynau.pdf (ngày truy cập 8 – 01 – 2009).
http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/rgn/vol8/v8p125.html (ngày truy cập 8 – 01 – 2009). http://www.khuyennongvn.gov.vn (ngày truy cập 8 – 01 – 2009).
http://www.ngoctung.com/news.php?id=28 (ngày truy cập 8 – 01 – 2009).
http://www.baocantho.com.vn/?mod=detnews&catid=63&p=&id=17531 (ngày truy cập 10 – 01 – 2009).
http://vaas.org.vn/download/caylua/10/059_raynau.htm(ngày truy cập 15 – 03 – 2009) http://www.quangngai.gov.vn/quangngai/tiengviet/bangtin/images/a3.JPG (ngày truy cập 15 – 03 – 2009)
http://www.khuyennongvn.gov.vn/c-hdknkn/b-tthuanluyen/fao-111anh-gia-cao-mo-hinh-bay- 111en-diet-ray-nau-cua-vn/view (ngày truy cập 18 – 03 – 2009 )
http://www.agro.gov.vn/images/2007/02/29840.jpg (ngày truy cập 18 – 03 – 2009) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
http://www.mpbio.com/product_info.php?products_id=151260 (ngày truy cập 18 – 03 – 2009)
ReadSamples Method SaveClear Print Quit
Results file: A:\ WORK_RES Method name:A:\DEFAULT Assay type: General Ratio and concentration Units: ug/Ml
Formula setup: View Background Correction: [No] Sampling device: None Concentration: [No]
Read average time: 0.50 sec Peak pick: [No]
Mẫu 260nm 260nm/280nm Nồng độ ADN (µg/ml) 1b 0.4492 1.9145 429.9967 2a 0.4046 2.0561 415.94903 2b 0.3835 2.1131 405.186925 3a 1.5991 1.9254 1539.45357 3b 1.676 1.8422 1543.7636 4b 0.3162 1.9756 312.34236 5a 0.0984 1.9803 97.43076 5b 0.0892 1.8816 83.91936 7a 0.1283 1.9758 126.74757 7b 0.7914 2.0187 798.79959 8a 0.132 1.8105 119.493 8b 0.1338 1.8865 126.20685 10a 0.4634 1.9699 456.42583 10b 0.2508 1.792 224.7168 11a 0.3501 1.9416 339.87708 11b 0.1099 1.9716 108.33942 13a 0.609 1.7255 525.41475 13b 0.2635 1.8678 246.08265 14a 0.5863 1.8886 553.64309 15a 0.7184 1.8451 662.75992
16a 16b 17a 17b 18a 18b 19a 19b 20a 20b 21a 21b 22a 22b 24a 24b 8a
8b 26a 26b 14b 15b
Kết quả kiểm tra DNA trên gel Agarose
* 1a 4a 6a 6b 9a 9b 12a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M
27 28 29 30 M
Kết quả PCR với cặp mồi RG457FL/RL
PCR 6 8 25 26 M 7 8 9 10 11 21 22 23 24 25 26 M
Kết quả cắt bằng enzyme HinfI
(Số trên giếng là các ký hiệu mẫu, xem Bảng 3.1)
5. Hình lúa