B ảng 3.1 Danh sách giống lúa Số thứ
4.1. Kết quả trích DNA
(Số trên giếng là các ký hiệu mẫu, xem Bảng 3.1; *: DNA chuẩn)
Trích DNA của 30 giống lúa trồng, mỗi giống trích 2 tuýp DNA, kết quả chọn được 30 mẫu DNA tương đối sạch để thực hiện các bước phân tích tiếp theo. Qua kết quả kiểm tra DNA cho thấy hầu hết các mẫu đều có vạch DNA trên gel. Các vạch có độ đậm nhạt khác nhau tùy theo lượng DNA trích được nhiều hay ít (Hình 4.1).
Vach DNA
Hình 4.2. Kết quả PCR thử nghiệm 4.2. Kết quả PCR
4.2.1. Kết quả hiệu chỉnh
+ Thực hiện phản ứng theo công thức ở Bảng 3.2 với 30 chu kỳ.
(Số trên giếng là các ký hiệu mẫu, xem Bảng 3.1)
Theo Nguyễn Thị Giáng Đan (2008) thực hiện phản ứng PCR theo công thức ở Bảng 3.2 sẽ cho kết quả một vạch duy nhất rõ nét. Tuy nhiên kết quả trên gel cho thấy xuất hiện một vạch duy nhất nhưng các vạch khá mờ (Hình 4.2), ta không thể tiến hành các bước tiếp theo. Có nhiều nguyên nhân đã ảnh hưởng đến kết quả này, có thể do các thành phần trong ứng phản PCR: MgCl2, Taq polymerase, nhiệt độ gắn mồi (Tm), hoặc số chu kỳ,... Vì vậy ta cần phải hiệu chỉnh từng thông số của phản ứng PCR để tạo ra một vạch duy nhất và rõ nét.
+ Thực hiện phản ứng theo công thức ở Bảng 3.2 với 35 chu kỳ. 23 24 25 26
23 24 25 26
23 24 25 26
Hình 4.3. Kết quả PCR hiệu chỉnh
Hình 4.4. Kết quả PCR hiệu chỉnh nồng độ Taq polymerase
(Số trên giếng là các ký hiệu mẫu, xem Bảng 3.1)
Sau khi tăng số chu kỳ lên, ta thấy vạch sáng hơn và đậm hơn. Tuy nhiên, kết quả lại xuất hiện thêm các vạch phụ phía dưới (Hình 4.3). Khi ta tăng chu kỳ lên thì ngoài đoạn DNA mang gen mục đích được nhân lên tạo thành các vạch chính thì các đoạn DNA khác cũng được nhân lên nhiều hơn tạo nên vạch phụ. Vì vậy, ta tiến hành thay đổi nồng độ của Taq polymerase với mục đích giảm sự tạo thành vạch phụ.
+ Giảm nồng độ của Taq polymerase (0,5 µl).
23 23’ 23’’ 24 24’ 24’’ 25 25’’ 26 26’ 26’’
Hình 4.5. Kết quả PCR hiệu chỉnh với các nhiệt độ bắt cặp khác nhau
Sau khi giảm nồng độ của Taq polymerase, ta thấy vạch phụ đã mờ hơn (Hình 4.4), nhưng vạch chính cũng mờ theo, không còn rõ và đậm như ở Hình 4.3.Taq polymerase là enzyme dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có đủ 4 loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP, và dTTP) và hai đoạn mồi trên cơ sở khuôn mẫu của một DNA nhất định. Nếu nồng độ của Taq polymerase quá cao sẽ tạo ra các vạch phụ. Vì vậy, ta phải giảm nồng độ của Taq polymerase để giảm vạch phụ. Nhưng nồng độ Taq polymerase giảm cũng kéo theo giảm các vạch chính. Do vậy, ta cần tiếp tục thay đổi các thông số khác để được vạch chính đậm và không có vạch phụ.
+ Tăng nồng độ của MgCl2 (2 µl) nhằm mục đích tăng khả năng bắt cặp của mồi với đoạn DNA mang gen mục đích. Đồng thời tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ với nhiệt độ lần lượt là: 59oC, 60oC, 61oC. Từ đó ta có thể so sánh được ở nhiệt độ nào cho hiệu quả tốt hơn.
(Số trên giếng là các ký hiệu mẫu, xem Bảng 3.1)
Nghiệm thức 1: Các mẫu được ký hiệu là 23, 24, 25, 26 thực hiện phản ứng PCR ở nhiệt độ là 59oC.
23 24 25 26
Hình 4.6. Kết quả PCR với nhiệt độ bắt cặp 620C
Nghiệm thức 2: Các mẫu được ký hiệu là 23’, 24’, 25’, 26’ thực hiện phản ứng PCR ở nhiệt độ là 60oC.
Nghiệm thức 3: Các mẫu được ký hiệu là 23’’, 24’’, 25’’, 26’’ thực hiện phản ứng PCR ở nhiệt độ là 61oC.
Ở nghiệm thức 1 ta nhận thấy giếng 23, 24, 26 tạo vạch chính mờ và có một vạch phụ ở dưới, còn giếng 25 tạo vạch chính đậm hơn nhưng tạo nhiều vạch phụ hơn. Tương tự ở nghiệm thức 2 giếng 26’ cũng tạo nhiều vạch phụ (Hình 4.5). Các vạch ở hai nghiệm thức này không đều nhau nguyên nhân là do Tm sử dụng để tiến hành phản ứng PCR chưa phù hợp cho tất cả các giống. Đối với nghiệm thức 3, các giếng tạo vạch chính tương đối đều nhau có thể tiến hành các bước tiếp theo. Vì vậy ta chọn nghiệm thức 3 tiếp tục hiệu chỉnh nhiệt độ để giảm các vạch phụ.
+ Từ kết quả của nghiệm thức 3 ta tiếp tục tăng Tm lên 62oC nhằm mục đích làm giảm hoặc ngăn cản sự tạo thành vạch phụ.
(Số trên giếng là các ký hiệu mẫu, xem Bảng 3.1)
Kết quả thể hiện vạch chính rõ nét và không còn vạch phụ phía dưới khi kiểm tra trên gel Agarose (Hình 4.6). Từ đó ta tiến hành phản ứng PCR theo công thức này cho các giống còn lại.
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 M
Hình 4.7. Kết quả PCR với cặp mồi RG457FL/RL
4.2.2. Kết quả PCR
(Số trên giếng là các ký hiệu mẫu, xem Bảng 3.1)
Kết quả PCR cho thấy 30 giống lúa đều tạo ra một vạch sáng có kích thước tương đương nhau 750 – 800 bp (Hình 4.7). Với dấu phân tử này thì không phân biệt được giống kháng rầy nâu và giống nhiễm rầy nâu. Kết quả này thể hiện sự đa hình không cao, ta cần lấy sản phẩm PCR cắt với enzyme HinfI để tìm ra sự đa hình giữa các giống lúa.
1000 bp 500 bp 750 – 800 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M