5. Ý nghĩa của đề tài
2.2.5. Tạo cây hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để có thể chuyển ra trồng ngoài tự nhiên. Cây con đƣa ra ngoài tự nhiên phải khỏe mạnh, sức đề kháng tốt nhằm nâng cao sức sống của cây khi ra môi trƣờng bên ngoài. Các chất kích thích sinh trƣởng tạo chồi đƣợc thay thế bởi các chất kích thích tạo rễ nhƣ: IBA, NAA…
Môi trƣờng đƣợc sử dụng trong các thí nghiệm này là: MS + 20g/l đƣờng + 8,5g/l agar + NAA (0,1; 0,2; 0,4; 0,6 mg/l) và có pH = 5,8. Tất cả các thí nghiệm đƣợc tiến hành ở điều kiện: Nhiệt độ 25-27ºC, thời gian chiếu sáng 12/24h, cƣờng độ chiếu sáng 2000lux.
2.2.6. Đưa cây ra trồng
Đây là một trong những giai đoạn rất quan trọng trong quá trình nuôi cấy
in vitro. Giai đoạn này cây con cần sự thích nghi dần dần với điều kiện tự nhiên. Quá trình thích nghi ở đây đƣợc hiểu là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh lý thực vật và giải phẫu của bản thân cây non. Thời gian tối thiểu
cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần, trong thời gian này cây con phải đƣợc chăm sóc và bảo vệ trƣớc những yếu tố bất lợi nhƣ:
- Mất nƣớc nhanh làm cây bị héo khô.
- Nhiễm vi khuẩn và nấm gây ra hiện tƣợng thối nhũn. - Cháy lá do nắng.
- Các loài côn trùng tấn công.
Mục đích của thí nghiệm này là tìm ra giá thể thích hợp cho cây con phát triển.
Các loại giá thể đƣợc sử dụng để trồng cây con in vitro là:
- Đất
- Đất + Cát (1:1)
- Nƣớc
2.3. Thu thập và xử lý số liệu
Các chỉ tiêu theo dõi và đƣợc đánh giá nhƣ sau:
- Tỷ lệ hạt nhiễm (%) = số hạt bị nhiễm/tổng số hạt cấy × 100
- Tỷ lệ hạt tạo mô sẹo (%) = Tổng số mô sẹo/tổng số mẫu nuôi cấy × 100 - Tỷ lệ mô sẹo tái sinh (%) = Tổng số mô tái sinh cây/tổng số mô sẹo nuôi cấy × 100
- Số chồi TB / mô = Tổng số chồi/tổng số mô sẹo có chồi tái sinh - Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = Tổng số chồi có rễ/tổng số chồi nuôi cấy × 100 - Số rễ TB / cây = Tổng số rễ/tổng số cây tạo rễ
Các số liệu đƣợc tính toán theo phƣơng pháp thống kê toán học. Quá trình xử lý đƣợc thực hiện trên máy vi tính theo chƣơng trình Excel 5,0 và đƣợc mô phỏng bằng các bảng biểu và hình.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo nguyên liệu vô trùng
Đây là giai đoạn đầu tiên, có vai trò quan trọng cung cấp nguyên liệu cho các giai đoạn của những nghiên cứu tiếp theo. Yêu cầu của giai đoạn này là tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ tạo mô sẹo cao. Hạt ở ngoài môi trƣờng tự nhiên có chứa nhiều vi khuẩn, nầm mốc… do vậy, trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy yêu cầu cần thiết phải khử trùng để diệt và loại sạch vi khuẩn, nấm mốc…
Bảng 3.1: Tỷ lệ hạt nhiễm khi khử trùng
Giống Tổng số hạt cấy Tỷ lệ nhiễm (%)
NIP1 300 4,7
NH2 300 4,3
NH3 300 6,0
Kết quả khử trùng mẫu thu đƣợc ở bảng 3.1, số liệu ở bảng 3.1 cho thấy khi khử trùng hạt gạo của cả 3 giống bằng dung dịch javel 70% đều cho tỷ lệ mẫu nhiễm tƣơng đối thấp. Tỷ lệ mẫu nhiễm khi khử trùng thƣờng phụ thuộc rất nhiều yếu tố nhƣ: loại mẫu (hạt tƣơi, hạt khô, cành, chồi non…), thời gian thu hoạch và bảo quản mẫu (lâu hay nhanh), thời gian khử trùng mẫu, hóa chất sử dụng để khử trùng mẫu.
3.2. Tạo mô sẹo
Trong môi trƣờng nuôi cấy in vitro, bên cạnh các chất đa lƣợng, vi lƣợng, vitamin còn bổ sung nhiều loại kích thích sinh trƣởng (KTST) thuộc nhóm auxin, cytokinin… là rất cần thiết để kích thích sự sinh trƣởng, phát triển và phân hóa cơ quan. Tuy nhiên yêu cầu với những chất này thay đổi tùy theo loài cây, loại mô, mục đích nghiên cứu. Đặc biệt, việc sử dụng tổ hợp các chất KTST trong môi trƣờng nuôi cấy tỏ ra hiệu quả hơn so với khi sử dụng từng chất riêng biệt.
Mặt khác trong các hệ thống nuôi cấy, tỷ lệ auxin/cytokinin có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.
Việc tìm ra công thức môi trƣờng với nồng độ và tỷ lệ chất kích thích sinh trƣởng phù hợp cho từng loại cây, từng giai đoạn nuôi cấy là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo và quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy
in vitro.
3.2.1. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo
Hạt gạo sau khi vô trùng đƣợc cấy trên môi trƣờng tạo mô sẹo CT1 (MS+ 2mg/l 2,4D), sau 4 tuần nuôi xác định tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo.
Bảng 3.2: Tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trƣờng 2,4D (2 mg/l)
Giống NIP1 NH2 NH3
Số hạt cấy 132 140 117
Số hạt tạo mô sẹo 124 128 106
Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.2, ta thấy với nồng độ 2 mg/l 2,4D thì khả năng tạo mô sẹo ở cả ba giống lúa NIP1, NH2, NH3 tƣơng đối cao, tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất ở giống NIP1. Theo quan sát thì các mô sẹo đƣợc tạo ra trên môi trƣờng này thƣờng nhỏ, cứng. Theo những nghiên cứu trƣớc đây thì loại mô sẹo này thƣờng không thích hợp cho quá trình tái sinh cây.
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tạo mô sẹo
Để tối ƣu hóa môi trƣờng tạo mô sẹo phục vụ các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi sử dụng môi trƣờng CT2 (2 mg/l 2,4D + BAP (0,2 mg/l) và môi trƣờng CT3 0,5 mg/l), sau 4 tuần nuôi cấy thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.3.
Bảng 3.3: Tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trƣờng CT2
Giống NIP1 NH2 NH3
Nồng độ BAP (mg/l) 0,2 0,5 0,2 0,5 0,2 0,5
Số hạt cấy 120 115 110 124 118 130
Số hạt tạo mô sẹo 109 104 102 116 106 119
Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) 90,8 90,4 92,7 93,5 89,8 91,5
Theo kết quả ở bảng 3.3 thì khả năng tạo mô sẹo ở nồng độ 0,2 mg/l BAP tƣơng đối cao, chất lƣợng mô sẹo tốt, mô sẹo có màu vàng nhạt phù hợp với quá trình nuôi cấy tiếp theo (hình 3.1).
Với nồng độ BAP là 0,5mg/l thì tỷ lệ tạo mô sẹo cũng cao (hình 3.2), nhƣng khối mô sẹo thƣờng xốp, phát triển nhanh, mô nhanh chuyển màu vàng nâu và mọng nƣớc, không phù hợp với quá trình thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.1: Tạo mô sẹo giống lúa NIP1 và NH3 trên môi trƣờng 02mg/l BAP 87 88 89 90 91 92 93 94 NIP1 NH2 NH3 CT1 CT2 CT3
Hình 3.2: Tỷ lệ tạo mô sẹo của các giống trên các công thức môi trƣờng Qua kết quả thu đƣợc từ các thí nghiệm ở ba môi trƣờng khác nhau CT1, CT2 và CT3, thì chúng nhận thấy công thức CT2 là phù hợp nhất để làm môi trƣờng tạo mô sẹo đối với 3 giống lúa Nhật Bản .
3.3. Nhân mô sẹo
Để có mô sẹo đồng đều với số lƣợng đủ lớn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo thì cần thiết phải nhân mô sẹo. Theo những nghiên cứu trƣớc đây thì khi nhân mô sẹo với nồng độ 2,4D cao sẽ gây độc cho mô sẹo và làm mô sẹo nhanh chết hoặc ảnh hƣởng đến chất lƣợng mô sẹo và khả năng tái sinh cây. Vì vậy, đối với từng loại mô sẹo của các giống cây trồng khác nhau, nếu nhân mô sẹo thì cần phải xác định đƣợc nồng độ của 2,4D thích hợp. Ở đây, chúng tôi đã sử dụng các nồng độ 2,4D từ 0,9 mg/l trở xuống và sau 15 ngày nuôi thu đƣợc kết quả ở bảng 3.4.
Bảng 3.4: Đánh giá chất lƣợng mô sẹo trên môi trƣờng nhân mô sẹo
Nồng độ 2,4D (mg/l) Chất lƣợng mô sẹo
0,9 Nhân nhanh, mô xốp, bị chết nhiều
0,7 Nhân nhanh, một số mô bị chết
0,5 Nhân nhanh, mô phát triển tốt, đồng đều
0,3 Nhân chậm, mô nhỏ, bị cứng
0,1 Nhân rất chậm, mô nhỏ
ĐC (0,0) Không nhân
Kết quả cho thấy ở các nồng độ 0,9 mg/l xuống 0,5 mg/l 2,4D thì mô sẹo đƣợc nhân lên nhanh nhƣng ở nồng độ 0,9 mg/l do còn cao nên mô sẹo bị ngộ độc và nhiều mô bị chết. Ở các nồng độ 0,3 mg/l và 0,1 mg/l thì mô sẹo đƣợc nhân lên chậm, trong khí đó trên môi trƣờng không có 2,4D thì mố ẹo không
thể nhân lên đƣợc. Nhƣng ở nồng độ 0,5 mg/l 2,4D thì mô sẹo đƣợc nhân nhanh, phát triển tốt và đồng đều (hình 3.3). Nhƣ vậy, có thể sử dụng môi trƣờng bổ sung 0,5 mg/l 2,4D để nhân mô sẹo với khối lƣợng lớn phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.3: Nhân mô sẹo giống NH2 trên môi trƣờng có 0,5mg/l BAP
3.4. Tái sinh cây
3.4.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin tới khả năng tái sinh cây
Mô sẹo sau khi nhân đƣợc cấy chuyển sang nuôi cấy ở môi trƣờng TS1 có bổ sung 2mg/l BAP và kinetin ở các nồng độ thay đổi (0,1 - 0,9mg/l). Sau khi nuôi cấy 1 tháng thì thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.5.
Bảng 3.5: Tỷ lệ tái sinh cây trên môi trƣờng TS1
Tên giống NIP1 NH2 NH3
Nồng độ kinetin (mg/l) Tỷ lệ tái sinh (%) Chồi TB/mô Tỷ lệ tái sinh (%) Chồi TB/mô Tỷ lệ tái sinh (%) Chồi TB/mô ĐC 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 36,7 3,3 33,3 3,1 40,0 3,4 0,3 46,7 4,2 41,7 4,4 51,7 4,7 0,5 41,7 4,0 40,0 4,1 45,0 4,1 0,7 35,0 3,6 31,7 3,7 41,7 3,8 0,9 33,3 2,9 25,0 3,3 35,0 3,5
Ở các nồng độ kinetin khác nhau, kết quả thu đƣợc cho thấy với nồng độ 0,9mg/l tỷ lệ tái sinh thấp nhất là 25,0% (giống NH2) và cao nhất là 51,7% ở nồng độ 0,3mg/l (giống NH3). Tỷ lệ tái sinh cây thƣờng phụ thuộc từng nồng độ các chất KTST trên các loại môi trƣờng khác nhau và kiểu gen từng giống. Nhìn chung, ở nồng độ kinetin là 0,3mg/l cho tỷ lệ tái sinh cây là cao nhất đối với 3 giống nghiên cứu.
Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.5 cũng cho thấy số chồi trung bình/mô ở nồng độ kinetin là 0,3mg/l là cao hơn cả đối với 3 giống. Nhƣ vậy, trên môi trƣờng tái sinh cây với nồng độ Kinetin khác nhau thì ở nồng độ 0,3 mg/l thì tỷ lệ tái sinh cây và số mô/cây là cao nhất.
3.4.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA tới khả năng tái sinh cây
Trên công thức môi trƣờng TS2 nồng độ BAP vần giữ nguyên là 2mg/l và bổ sung NAA ở các nồng độ từ 0,1 mg/l đến 0,9 mg/l thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.6.
Bảng 3.6: Tỷ lệ tái sinh cây trên môi trƣờng TS2
Tên giống NIP1 NH2 NH3
Nồng độ NAA (mg/l) Tỷ lệ tái sinh (%) Chồi TB/mô Tỷ lệ tái sinh (%) Chồi TB/mô Tỷ lệ tái sinh (%) Chồi TB/mô ĐC 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 28,3 2,5 36,7 2,3 33,3 2,6 0,3 36,7 3,4 40,0 3,7 38,3 2,9 0,5 33,3 3,2 33,3 3,6 35,0 2,2 0,7 28,3 2,8 31,7 3,2 30,0 1,9 0,9 26,7 2,4 31,7 2,6 23,3 1,8
Theo kết quả ở bảng trên, tỷ lệ mô sẹo tái sinh cây thấp nhất ở nồng độ NAA 0,9 mg/l là 23,3% đối với giống NH3, số chồi trung bình/mô là 1,8. Tỷ lệ tái sinh cao nhất là 40,0% tƣơng ứng với số chồi trung bình nhiều nhất là 3,7 ở nồng độ 0,3 mg/l NAA đối với giống NH2. Nhìn chung, tỷ lệ tái sinh cao nhất của cả ba giống đều ở nồng độ 0,3 mg/l NAA. So với các nghiên cứu trƣớc đây trên các giống lúa khác, thì tỷ lệ tái sinh của các giống lúa trong nghiên cứu này thấp hơn (Lê Xuân Đắc, 2008) [3].
Tổng hợp kết quả thu đƣợc ở bảng 3.5 và 3.6, ta thấy trên môi trƣờng TS1 có nồng độ BAP là 2mg/l và kinetin là 0,3mg/l cho tỷ lệ tái sinh cây và số cây trung bình/mô là cao nhất (hình 3.5). Vì vậy, có thể sử dụng môi trƣờng có nồng độ BAP là 2mg/l và kinetin là 0,3mg/l để tái sinh cây phục vụ các làm thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.4: Tái sinh cây giống NIP1 (BAP 2mg/l và kinetin 0,3mg/l)
3.5. Tạo cây hoàn chỉnh
Ra rễ là khâu cuối cùng của giai đoạn nghiên cứu in vitro. Ở thí nghiệm này chúng tôi sử dụng môi trƣờng MS + 20g đƣờng + 8g agar + NAA ở các nồng độ khác nhau từ 0,1 mg/l đến 0,6 mg/l. Kết quả thu đƣợc nhƣ ở bảng 3.7.
Bảng 3.7: Khả năng tạo cây hoàn chỉnh
Giống NIP1 NH2 NH3 Ghi chú
Nồng độ NAA Số rễ/cây Tỷ lệ cây tạo rễ (%) Số rễ/cây Tỷ lệ cây tạo rễ (%) Số rễ/cây Tỷ lệ cây tạo rễ (%) ĐC 3,2 95 3,4 91 3,1 94 Ít rễ, rễ ngắn, cây phát triển chậm 0,1 3,6 100 3,7 100 3,5 100 Ít rễ, rễ ngắn, cây phát triển chậm 0,2 4,6 100 4,4 100 4,3 100 Số rễ TB, cây phát triển bình thƣờng 0,4 4,5 100 4,9 100 5,1 100 Số rễ TB, rễ dài, có
mô sẹo ở gốc cây
0,6 5,3 100 5,6 100 5,4 100 Số rễ nhiều, rễ dài,
có nhiều mô sẹo ở gốc cây
Theo kết quả ở bảng 3.7, thì trên môi trƣờng đối chứng MS không có NAA thì cây vẫn tạo rễ, nhƣng tỷ lệ cây ra rễ thấp hơn so với môi trƣờng có bổ sung NAA. Ở tất cả các nồng độ đều thu đƣợc tỷ lệ ra rễ là 100% nhƣng số rễ trung bình trên một cây nhiều hay ít tùy thuộc vào nồng độ NAA. Số rễ trung bình của cây tăng theo sự tăng nồng độ của NAA. Tuy nhiên, ở nồng độ 0,4 và 0,6 mg/l có số rễ trung bình cao, rễ dài nhƣng xuất hiện khối mô sẹo ở gốc cây, điều này ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng sống khi cây đƣợc đƣa ra điều kiện tự nhiên. Ở nồng độ 0,2 mg/l có số rễ vừa phải, cây có màu xanh đều và phát triển bình thƣờng (hình 3.6). Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn
môi trƣờng MS + 20g đƣờng + 8g agar + 0,2 mg/l NAA làm môi trƣờng tái sinh cây đối với 3 giống lúa Nhật Bản phục vụ các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.5: Tạo cây hoàn chỉnh giống NH3
3.6. Ảnh hƣởng của giá thể tới khả năng sống của cây
Cây in vitro đƣợc nuôi trong điều kiện ổn định về nguồn dinh dƣỡng, ánh sánh, nhiệt độ… Khi chuyển ra ngoài môi trƣờng tự nhiên hoàn toàn khác cây nên con dễ bị chết do mất nƣớc, nhiệt độ cao… Vì thế ta phải tiến hành làm cho cây con thích nghi dần với điều kiện ngoài tự nhiên. Thời gian tối thiểu để cây con có thể thích nghi đƣợc với điều kiện bên ngoài là khoảng 2 - 3 tuần. Trong thời gian này cây con cần đƣợc chăm sóc và bảo vệ cẩn thận.
Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm trên 3 loại giá thể khác nhau:
- Đất
- Đất + Cát (1:1)
Sau khi tạo đƣợc cây con hoàn chỉnh ta tiến hành trồng vào các loại giá thể trên. Các khay trồng cây đƣợc phủ kín bằng nilon trong tuần đầu tiên, đặt ở nơi có ánh sáng khuyếch tán, thoáng mát,. Tỷ lệ cây con sống sau 15 ngày trên các loại giá thể khác nhau thu đƣợc ở bảng 3.8.
Bảng 3.8: Tỷ lệ cây sống trên các loại giá thể
Loại giá thể Số cây trồng Số cây sống Tỷ lệ sống (%)
Đất 80 43 53,8
Đất + Cát (1:1) 67 47 70,1
Nƣớc 75 68 90,7
Theo kết quả ở bảng 3.8 cho thấy các loại giá thể ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng sống sót của cây lúa nuôi cấy in vitro. Trên giá thể đất cây con có tỷ lệ sống thấp nhất là 53,8% và ở nƣớc có tỷ lệ sống cao nhất là 90,7% (hình 3.7). Dựa vào kết quả trên, chúng tôi quyết định chọn nƣớc làm giá thể nuôi cấy cây lúa in vitro.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Bƣớc đầu đã xây dựng đƣợc hệ thống nuôi cấy in vitro của ba giống lúa NIP1, NH2 và NH3 có nguồn gốc từ Nhật Bản.
1. Môi trƣờng thích hợp để tạo mô sẹo là MS + 20g đƣờng + 8g agar + 2 mg/l