4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
2.5.Phạm vi nghiên cứu
Chủng nấm men S. cerevisiae tuyển chọn trên đối tượng là quả táo mèo.
2.6. Địa điểm thực hiện đề tài
Phòng thí nghiệm Vi sinh. Khoa sinh-KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.7. Thời gian thực hiện đề tài
28
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men lên men vang táo mèo
3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
Nguyên liệu sử dụng để sản xuất rượu vang là quả táo mèo. Quả táo mèo sau khi thu hoạch về chọn các quả chín đem rửa sạch, loại bỏ các quả non và các quả bị dập nát, để ráo nước rồi cho vào các bình sạch ngâm đường theo tỉ lệ 1:1. Sau khoảng một tháng thu được dung dịch siro nước quả có nồng độ đường khoảng 60-80% và nhiều dưỡng chất khác chiết ra từ thịt quả, tiến hành vớt xác quả ra và lọc dịch nước quả.
Khi dịch nước quả có hiện tượng lên men tiến hành phân lập. Môi trường đã hấp vô trùng được cho vào các đĩa petri vô trùng. Tiến hành pha loãng dịch quả, chuẩn bị 10 ống ngiệm cho vào mỗi ống 10ml nước, sau đó đậy nút bông và tiến hành hấp khử trùng ở 1200
C, 1atm, trong 20 phút. Sau khi khử trùng đưa các ống nghiệm vào buồng cấy vô trùng, dùng pipet hút lấy 1ml dịch quả cho vào ống nghiệm thứ nhất rồi đậy nút bông lại và lắc đều (đây là ống nghiệm có chứa dịch pha loãng ở mức 10-1). Sau đó lại hút 1ml dịch ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-1 cho vào ống 2 và lặp lại các thao tác sẽ thu được dịch lên men pha loãng ở các mức độ từ 10-1-10-10, sau đó tiến hành chọn mẫu có mức độ pha loãng từ 10-7-10-9 để tiến hành các bước tiếp theo.
Tiến hành phân lập nấm men trên môi trường thạch đĩa, dùng pipet hút dịch lên men trong các ống nghiệm pha loãng mà ta đã chọn ở trên, nhỏ vào hộp petri mỗi hộp nhỏ tử 1-2 giọt, dùng que trang thuỷ tinh dàn đều giọt dịch lên men ra khắp bề mặt thạch. Đặt ngược các hộp petri rồi bao gói lại, đặt vào trong tủ ấm ở 28-300C trong 3 ngày. Sau 3 ngày lấy ra quan sát chọn những
29
khuẩn lạc to, trơn, nhẵn, bóng đem cấy riêng rẽ vào các ống thạch nghiêng. Từ các mẫu nấm men phân lập được chúng tôi chọn ra ba mẫu có khuẩn lạc lớn nhất để tiến hành tiếp tục nghiên cứu, ba mẫu nấm men này được kí hiệu là M1, M2, M3.
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo
Chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng nấm men lên men rượu vang từ dịch táo mèo dựa trên các tiêu chí cơ bản sau:
Có khả năng lên men tốt trong môi trường có hàm lượng đường cao. Chịu được độ cồn và độ axit cao.
Có hiệu suất lên men cao.
Có khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm. Tạo được hương thơm và vị đặc trưng.
3.1.2.1. Xác định hoạt lực lên men
Để xác định hoạt lực lên men chúng tôi cho ba mẫu nấm men M1, M2, M3 vào môi trường dịch quả 100ml có hàm lượng đường 250g/l, pH: 4, số lượng giống ban đầu (3,5 ± 0,1) x 106
TB/ml, nhiệt độ từ 25-280C, nồng độ KH2PO4 0,8‰. Hoạt lực lên men của các chủng được xác định bằng lượng CO2 thoát ra. Lượng CO2 sinh ra càng nhiều và thoát ra ngoài môi trường thì trọng lượng bình lên men càng giảm. Điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Kết quả thu được dẫn ra ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hoạt lực lên men của ba mẫu nấm men M1, M2, M3 (g/100ml) sau 120h Tên mẫu nấm men Trọng lượng bình ban đầu (g) Trọng lượng bình sau 5 ngày lên men (g)
Lượng CO2 thoát ra (g)
M1 154,84 153,16 1,68
M2 147,24 145,72 1,52
30 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ kết quả của bảng trên, chúng tôi thấy rằng mẫu nấm men M1 có hoạt lực lên men mạnh nhất tiếp đến là mẫu M2 và M3.
3.1.2.2. Khả năng lên men đường
Các mẫu nấm men được cấy vào môi trường dịch táo mèo và bổ sung đường đạt 250g/l, pH:4, giữ ở nhiệt độ từ 25-280
C, số lượng giống ban đầu 3,5 x 106 TB/ml. Xác định các chỉ tiêu cần thiết thu được kết quả ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Khả năng lên men của ba mẫu nấm men M1, M2, M3
trên môi trường lên men
Chỉ tiêu đánh giá Đơn vị Mẫu nấm men M1 M2 M3 Đường tổng số g/l 250±0,2 250±0,2 250±0,2 HL đường sót % 5,25±0,01 6,18±0,03 6,81±0,2 HL cồn %V 9,9±0,03 9,4±0,02 9,0±0,01
Qua bảng trên chúng tôi thấy mẫu nấm men M1 lên men cho hàm lượng cồn cao nhất sau đó là mẫu M2, M3.
3.1.2.3. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau của ba mẫu M1, M2, M3
Để xác định khả năng lên men của ba mẫu nấm men M1, M2, M3 ở các độ pH khác nhau, chúng tôi tiến hành lên men trong môi trường dịch táo có hàm lượng đường 250 g/l, nhiệt độ 25-280
C, số lượng giống ban đầu 3,5 x 106 TB/ml, KH2PO4 0,8‰, pH biến đổi ở các mức: 3; 3,5; 4; 4,5; 5. Xác định hàm lượng CO2 /l môi trường sau 24h nuôi cấy chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.3.
31
Bảng 3.3. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau của ba mẫu nấm men M1, M2, M3
Mẫu pH
3 3,5 4 4,5 5
M1 + +++ +++ +++ ++
M2 + ++ ++ +++ +++
M3 + ++ ++ +++ ++
Trong đó: +++: Hàm lượng CO2 được tạo ra trên 40g/l dịch lên men. ++ : Hàm lượng CO2 được tạo ra từ 30-40g/l dịch lên men. + : Hàm lượng CO2 được tạo ra dưới 30g/l dịch lên men.
Từ kết quả thu được cho thấy rằng: mẫu nấm men M2 có khả năng lên men mạnh ở môi trường có pH: 5 nhưng pH: 3,5-4,5 là phù hợp với pH dịch quả. Do đó, mẫu M1 vẫn là mẫu nấm men có khả năng lên men tốt nhất trong môi trường có dịch quả.
3.1.2.4. Khả năng kết lắng của ba mẫu nấm men M1, M2, M3
Hòa sinh khối nấm men thu được vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy với tốc độ 200 vòng /phút trong thời gian 3-5 phút. Chúng tôi thu được kết quả sau:
Bảng 3.4. Khả năng kết lắng của ba mẫu nấm men M1, M2, M3
Tên mẫu nấm men M1 M2 M3
Chiều cao cột sinh khối (mm) 15,5 13 11
Theo kết quả ở bảng trên, mẫu nấm men có khả năng kết lắng tốt nhất là M1 tiếp theo là mẫu M2, kém nhất là mẫu M3.
32
3.1.2.5. Khả năng tạo hương thơm và độ trong của ba mẫu nấm men M1, M2, M3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi kết thúc lên men được 15 ngày chúng tôi xác định khả tạo hương thơm và độ trong của sản phẩm bằng phương pháp cảm quan (bảng 2.1). Chúng tôi có kết quả phân tích sau:
Bảng 3.5. Khả năng tạo hương thơm và độ trong của ba mẫu nấm men M1, M2, M3
STT Chỉ tiêu đánh giá Mẫu
M1 M2 M3 1 Độ trong 2 1,5 1 2 Màu sắc 2 1 1 3 Vị chua 1,5 1 1 4 Vị chát 2 1,5 1,5 5 Vị ngọt 2 2 1 6 Mức độ hài hòa 2,5 2 1 7 Tính đặc trưng 4 2 2 8 Đánh giá chung 3 2,5 2 Tổng điểm 19 13,5 10,5
Kết quả phân tích cho thấy, mẫu nấm men M1 đạt hương thơm và độ trong tốt hơn mẫu M2, M3.
Tổng hợp kết quả nghiên cứu của 3 mẫu nấm men, chúng tôi thấy mẫu nấm men M1 có khả năng lên men tốt nhất và tạo sản phẩm có nhiều ưu điểm. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn mẫu nấm men M1 cho các nghiên cứu tiếp theo.
33
3.1.3. Xác định tên khoa học của chủng nấm men
Để xác định tên khoa học của chủng nấm men ở mẫu M1 chúng tôi dựa vào các đặc tính sinh học của nấm men như:
Khả năng lên men các loại đường. Khả năng đồng hóa các muối nitrat.
Khả năng hình thành bào tử kết hợp quan sát khuẩn lạc. Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi.
Sinh sản nảy chồi nhiều phía.
3.1.3.1. Hình thái tế bào và khuẩn lạc
Khuẩn lạc của mẫu nấm men M1 cấy trên môi trường Hansen sau 2-3 ngày là những khuẩn lạc hình tròn, màu trắng, viền xung quanh nhẵn (hình 3.1). Nấm men ở mẫu M1 bao gồm các tế bào có hình ovan (hoặc hình trứng) (hình 3.2).
Sau đây là một số hình ảnh chụp mẫu nấm men M1
Hình 3.1. Ảnh chụp khuẩn lạc của mẫu nấm men M1
34
Hình 3.2. Ảnh chụp tế bào mẫu nấm men M1
Hình 3.3. Cấy chuyền mẫu nấm men M1 trên thạch nghiêng 3.1.3.2. Xác định tên khoa học
Căn cứ vào khóa phân loại của Lodder (1970) và các kết quả thí nghiệm đối với mẫu nấm men M1 có đặc tính:
Sinh sản nảy chồi nhiều phía. Tế bào hình trứng, ovan, cầu. Lên men glucose mạnh.
Điều kiện không thuận lợi hình thành 1-4 bào tử.
Từ đó chúng tôi xác định chính xác tên khoa học của chủng nấm men ở mẫu M1 phân lập từ dịch táo mèo là S.cerevisiae M1.
35
3.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng tới quá trình lên men vang táo mèo
3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng đường
Trong quá trình lên men, hàm lượng rượu sinh ra chủ yếu từ quá trình chuyển hóa đường của nấm men. Do đó, yếu tố môi trường phải nghiên cứu đầu tiên là ảnh hưởng của hàm lượng đường tới quá trình lên men. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Do vậy, để xác định hàm lượng đường thích hợp cho quá trình lên men chúng tôi tiến hành cho chủng S.cerevisiae M1 lên men ở 5 hàm lượng đường: 180g/l, 210g/l, 230g/l, 250g/l, 280g/l, pH: 4, nhiệt độ giữ ổn định 280C, hàm lượng men giống 10%, nồng độ KH2PO4 0,8‰. Xác định hàm lượng cồn, hàm lượng đường sót. Kết quả thu được dẫn ra ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men của chủng nấm men S.cerevisiae M1 Tiêu chuẩn đánh giá Đơn vị Hàm lượng đường (g/l) 180 210 230 250 280 Thời gian
lên men Ngày 15 15 15 15 15
HL đường
sót g/l 5,3±0,2 5,5±0,2 5,7±0,2 6,0±0,2 8,22±0,2 HL cồn %V 6,35±0,2 7,75±0,2 8,65±0,2 9,7±0,2 9,5±0,2
36 5.3 5.5 5.7 6 8.22 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hàm lượ ng đườ ng sót g/l 180 210 230 250 280 Hàm lượng đường g/l
Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường sót trong dịch lên men ở các hàm lượng đường khác nhau
6.35 7.75 8.65 9.7 9.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 H àm l ư ợn g cồ n %V 180 210 230 250 280 Hàm lượng đường g/l
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng cồn trong dịch lên men ở các hàm lượng đường khác nhau
37 4 3.8 3.75 3.7 3.6 1 2 3 4 5 Đ ộ pH 180 210 230 250 280 Hàm lượng đường g/l
Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn độ pH trong dịch lên men ở các hàm lượng đường khác nhau
Qua bảng 3.6 và hình 3.4; 3.5; 3.6 nhận thấy khi hàm lượng đường trong dịch lên men tăng 180-280g/l thì hàm lượng đường sót tăng dần nhưng độ pH giảm.
Theo chúng tôi, khi hàm lượng đường trong dịch lên men tăng đã làm cho áp suất thẩm thấu của dịch lên men tăng lên cùng với lượng cồn và axit tạo ra trong quá trình lên men tăng dần đã ức chế quá trình trao đổi chất và hoạt động sống của nấm men cũng như ức chế hoạt động của nhiều loại enzyme làm cho hiệu suất lên men giảm, kéo theo hàm lượng đường sót tăng lên.
Khi hàm lượng đường trong dịch lên men từ 180-230g/l thì hàm lượng cồn thấp nên rất khó bảo quản và ổn định chất lượng trong quá trình tàng trữ và tiêu thụ.
Hàm lượng đường trong dịch lên men là 280g/l là cao mặc dù nấm men có thể tồn tại trong môi trường có hàm lượng đường cao. Song hiệu suất lên men và khả năng tạo cồn lại có giới hạn. Do đó, khi hàm lượng đường trong dịch lên men cao thì hàm lượng đường sót cũng tăng 8,22g/l là do quá trình
38
chuyển hóa đường thành rượu bị giảm mà nguyên nhân chính là do hoạt động của nấm men bị ức chế.
Từ kết quả trên cho thấy, hàm lượng đường ở 250g/l là phù hợp với quá trình lên men vang táo mèo.
3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ (NH4)2SO4
Trên quy mô phòng thí nghiệm, để xác định nguồn nitơ vô cơ (NH4)2SO4 phù hợp với sự phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae M1 chúng tôi tiến hành nghiên cứu thí nghiệm trong môi trường lên men với hàm lượng đường 250g/l, pH: 4, nhiệt độ là 280
C, (NH4)2SO4 ở các nồng độ 0,1‰; 0,2‰; 0,3‰; 0,4‰; 0,5‰. Kết quả nghiên cứu được dẫn ra ở bảng 3.7
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các nồng độ (NH4)2SO4 tới quá trình lên men của chủng nấm men S. cerevisiae M1 Chỉ tiêu đánh giá Đơn vị Nồng độ (NH4)2SO4 0,1‰ 0,2‰ 0,3‰ 0,4‰ 0,5‰ Thời gian
lên men Ngày 15 15 15 15 15
HL đường sót g/l 6,0±0,2 5,3±0,2 5,4±0,1 6,3±0,2 7,0±0,2 HL cồn %V 9,5±0,2 9,8±0,2 9,9±0,1 9,35±0,1 9,0±0,2 pH 3,8±0,2 3,8±0,2 3,7±0,2 3,6±0,2 3,4±0,2
39 6 5.3 5.4 6.3 7 0 1 2 3 4 5 6 7 H à m lư ợ ng đư ờ ng s ót g/ l 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nồng độ( NH4)2SO4
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường sót trong dịch lên men ở các nồng độ (NH4)2SO4 khác nhau 9.5 9.8 9.9 9.35 9 1 3 5 7 9 11 H àm l ư ợn g cồ n %V 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nồng độ (NH4)2SO4
Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng cồn trong dịch lên men ở các nồng độ (NH4)2SO4 khác nhau
40 3.8 3.8 3.7 3.6 3.4 0 1 2 3 4 Độ pH 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nồng độ (NH4)2SO4
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn độ pH trong dịch lên men ở các nồng độ (NH4)2SO4 khác nhau (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Qua bảng 3.7 và hình 3.7; 3.8; 3.9 cho thấy khi nồng độ (NH4)2SO4 ở 0,2-0,3‰ thì hàm lượng đường sót thấp là 5,3-5,4g/l, hàm lượng cồn đạt 9,8%V- 9,9%V. Nguyên nhân là do khi bổ sung một lượng thích hợp (NH4)2SO4 đã cung cấp nguyên liệu cho quá trình tổng hợp các thành phần của tế bào chứa nitơ. Đồng thời ở hàm lượng này nó điều chỉnh hoạt tính enzyme đồng hóa các loại thức ăn chứa cacbon, thúc đẩy quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men. Tuy nhiên, nếu bổ sung quá nhiều sẽ làm giảm pH (ở mức 0,5‰, pH thấp: 3,4) làm rối loạn quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men. Nếu quá ít (0,1‰) sẽ làm tốc độ lên men yếu, hàm lượng đường sót tăng, hàm lượng cồn giảm.
Do vậy, chúng tôi chọn nồng độ (NH4)2SO4 từ 0,2-0,3‰ là nồng độ thích hợp cho quá trình lên men vang táo mèo.
3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4
Để xác định nồng độ KH2PO4 cho quá trình lên men của chủng nấm men S. cerevisiae M1 tôi tiến hành thí nghiệm trong môi trường lên men có hàm lượng đường 250g/l, pH: 4, nhiệt độ là 280
41
0,6‰; 0,8‰; 1‰, 1,2‰. Xác định các chỉ tiêu hàm lượng cồn, hàm lượng đường sót. Kết quả được dẫn ra ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các nồng độ KH2PO4 tới quá trình lên men của chủng nấm men S.cerevisiae M1
Chỉ tiêu đánh giá Đơn vị
Nồng độ KH2PO4‰
0,6 0,8 1 1,2
Thời gian lên men Ngày 15 15 15 15
HL đường sót g/l 6,5±0,2 6,3±0,2 5,5±0,2 7,5±0,2 HL cồn %V 9,25±0,2 9,35±0,2 9,75±0,2 8,75±0,2 6.5 6.3 5.5 7.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 H àm l ư ợng đư ờng sót g/ l 0.6 0.8 1 1.2 Nồng độ KH2PO4
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường sót trong dịch lên men ở các nồng độ KH2PO4 khác nhau