3.1.1. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng γ-oryzanol
- Khảo sát tính thích hợp hệ thống
Pha mẫu đối chiếu có nồng độ 15ug/ml trong heptan, tiến hành quét phổ ở bước sóng 400-270nm, xác định λmax và độ hấp thụ tại λmax.
Kết quả : độ hấp thụ cực đại tại bước sóng khoảng 314nm và 290nm. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây và phù hợp với tiêu chuẩn của nhà sản xuất (Phụ lục 1).
Hình 3.1. Phổ hấp thụ của γ-oryzanol chuẩn trong dung môi heptan Bảng 3.1. Độ hấp thụ của dung dịch γ-oryzanol (15ug/ml)
1 2 3 4 5 6
λmax (nm) 314 314 314 314 314 314
A 0,5958 0,6003 0,5901 0,5923 0,5955 0,6001 SD=0,0041 RSD =0,68%
31
Các thông số trên chứng tỏ điều kiện và hệ thống UV-1800 là phù hợp và ổn định để đảm bảo phép phân tích định lượng γ-oryzanol và γ-oryzanol chuẩn phù hợp với tiêu chuẩn công bố.
Xác định bước sóng cực đại hấp của γ-oryzanol trong dầu cám gạo trong dung môi heptan.
Hình 3.2. Phổ hấp thụ của γ-oryzanol trong dầu cám và γ-oryzanol chuẩn
So sánh phổ hấp thụ của γ-oryzanol trong dầu cám và γ-oryzanol chuẩn trong dung môi heptan có thể kết luận dầu cám gạo không ảnh hưởng đến độ hấp thụ cực đại của γ-oryzanol ở λmax, do đó có thể định lượng γ-oryzanol trong dầu cám gạo bằng phương pháp đo quang ở bước sóng cực đại.
32
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa độ hấp thụ và nồng độ γ-oryzanol trong heptan, tại bƣớc sóng 314nm
Bảng 3.2. Độ hấp thụ quang của γ-oryzanol chuẩn tại các nồng độ khác nhau Nồng độ (µg/ml) Lần 4 6 8 10 12 15 16 1 0.1666 0.2423 0.3220 0.4051 0.4792 0.6003 0.6265 2 0.1661 0.2427 0.3226 0.4056 0.4797 0.5998 0.6269 3 0.1665 0.2425 0.3225 0.4058 0.4795 0.6000 0.6267
Kết quả xử lý thống kê, xác định các thông số của đường chuẩn như sau :
Hệ số Giá trị Sai số t Pr(>|t|)
b 0.0118 0.0024 4.8159 0.0001
a 0.0389 0.0002 174.3053 0.0000 R2: 0.9994
Phương trình đường chuẩn đầy đủ : Y = (0,0389 ±0,0002)X + (0,0118±0,0024) C (µg/ml)
33 Hệ số tương quan : r2
= 0,9994 Giới hạn phát hiện :
LOD = 3x 0,0024/0,0389 = 0,185 (µg/ml)
Giới hạn định lượng : LOQ = 10x 0,0024/0,0389 = 0,617 (µg/ml)
3.1.2. Khảo sát các loại cám gạo
Trong quy trình xay xát gạo, thu được 2 phần cám riêng biệt :
- Cám xát (C1) là phần cám thu được ở lần xát thứ nhất, cám có màu vàng đậm, bao gồm có vỏ trấu, 1 phần gạo, và lớp cám ngoài cùng.
- Cám xoa (C2) là phần cám thu được khi đánh bóng hạt gạo sau khi xát lần thứ nhất, cám có màu trắng ngà, bao gồm có 1 phần gạo, mầm hạt gạo, lớp cám bên trong.
- Trong quá trình nghiên cứu, chủ nhiệm đề tài tiến hành rây C2 qua cỡ rây 180µm, thu được cám mịn (C2m).
Kết quả khảo sát 2 loại cám C1, C2 được trình bày trong bảng dưới đây :
Bảng 3.2. Một số chỉ tiêu chất lƣợng của cám C1, C2 Tên mẫu Tỷ lệ trong cám (kl/kl) Độ ẩm (%) (x ± SD) Hàm lượng dầu (%) (x ± SD) Hàm lượng γ- oryzanol (%) (x ± SD) C1 60% 11,92±0,30 17,23±0,85 1,66±0,06 C2 40% 10,25 ±0,32 9,15±0,59 0,45±0,04 C2m 17,67 ±0,60 0.43 ± 0,05
C2m : là mẫu thu được khi rây C2 qua rây 180µm, khối lượng chiếm khoảng 30% mẫu C2.
Kết quả cho thấy, dầu cám gạo tập trung chủ yếu ở phần cám xát. Tuy nhiên, khi nghiên cứu đến phần cám mịn rây ra từ cám xoa (chủ yếu loại bỏ phần gạo vụn) hàm lượng dầu thu được tương đương với cám xát. Từ kết quả hàm lượng γ-oryzanol ta thấy rằng, γ-oryzanol chủ yếu có ở cám xát, hàm lượng cao gấp 4
34
lần so với cám xoa và cám mịn và γ-oryzanol phân bố chủ yếu ở lớp cám bên ngoài.
3.1.3. Khảo sát phƣơng pháp chiết xuất
- Khảo sát dung môi chiết xuất
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi được thể hiện trong bảng sau :
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của dung môi đến lƣợng dầu chiết đƣợc và hàm lƣợng γ-oryzanol trong dầu
Loại dung môi Lượng dầu chiết được (%) (x ± SD) Hàm lượng γ-oryzanol (%) (x ± SD) n-hexan 17,23±0,85 1,66±0,06 n-hexan –EtOH (9 :1) 15,58 ± 0,70 1,80±0,05 n-hexan – ISP (3 :1) 13,09 ± 0,76 1,52 ±0,04 n-hexan –ISP(1 :3) 9,93 ± 0,65 1,61±0,05 DCM –MeOH (2 :1) 9,5 ± 0,67 1,57±0,04
CO2 siêu tới hạn 18,7 ±0,80 2,02±0,09
+ Kết quả trên cho thấy, khi tăng dần độ phân cực của dung môi hữu cơ, hàm lượng dầu chiết được giảm đi. Khi kết hợp với đồng dung môi, ethanol cho hàm lượng γ-oryzanol cao nhất. Kết quả này phù hợp vì ethanol là dung môi chiết xuất γ-oryzanol cho hàm lượng cao.
+ Chiết bằng dung môi CO2 siêu tới hạn cho hiệu quả cao nhất cả về hàm lượng dầu và lượng γ-oryzanol chiết được.
+ Sử dụng hỗn hợp dung môi n-hexan –EtOH (9 :1) hoặc n- hexan có nhiều ưu điểm : thời gian chiết, hàm lượng γ-oryzanol trong dầu cao.
- Khảo sát thời gian chiết xuất
Trong thí nghiệm chiết cám C1 theo phương pháp Soxhlet bằng dung môi n- hexan, nhiệt độ chiết 800
C, ghi nhận thấy rằng : chu kì chiết lặp lại khoảng 20 phút/lần, sau 3 chu kì (60 phút) thấy dịch không còn màu vàng nhạt. Vì vậy,
35
tiến hành đánh giá ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu quả chiết dầu và γ- oryzanol theo các khoảng thời gian như sau, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng thời gian đến lƣợng dầu chiết đƣợc và hàm lƣợng γ-oryzanol trong dầu
Phân đoạn Lượng dầu chiết được (%) (x ± SD) Hàm lượng γ-oryzanol (%) (x ± SD) 0-60 phút 16,1 ± 0,43 1,59±0,05 60-180 phút 1,59± 0,58 --- 0-180 phút 17,3±0,07 1,65±0,04
Sau 3 chu kì chiết, hiệu suất chiết dầu đạt trên 90%, hàm lượng của γ- oryzanol trong mẫu dầu chiết 60 phút, và mẫu dầu chiết kiệt không có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê.
- Khảo sát nhiệt độ chiết xuất
Tiến hành thí nghiệm :
Mẫu 1 : ngâm có khuấy đảo C1 trong dung môi n-hexan, 3 lần, tỷ lệ dung môi/mẫu ( lần 1 : 5/1 trong 3 ngày, lần 2 : 2,5/1trong 2 ngày, lần 3 :2,5/1 trong 2 ngay) gộp dịch chiết, cô cạn dung môi.
Mẫu 2 : ngâm C1 trong n-hexan, 3 lần, tỷ lệ dung môi/mẫu : (lần 1 :5/1, lần 2 : 2,5/1, lần 3 : 2,5/1), ở nhiệt độ 700C, trong 60 phút, gộp dịch chiết, cô can dung môi. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.5.Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến lƣợng dầu chiết đƣợc và hàm lƣợng γ-oryzanol trong dầu
Tên mẫu Lượng dầu chiết được (%) (x ± SD)
Hàm lượng γ-oryzanol (%) (x ± SD)
Mẫu 1 13,06 ± 0,50 1,34±0,04
36
Ngoài ra, nhiệt độ còn ảnh hưởng tới lượng sáp có trong dầu. Quan sát mẫu chiết bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ thường có lượng sáp ít hơn nhiều so với khi chiết ở 700
C.
3.1.4. Tinh chế dầu cám gạo
Các kết quả thu được trình bày trong bảng 3.6, bảng 3.7 :
Bảng 3.6. Khối lƣợng dầu còn lại và hàm lƣợng γ-oryzanol trong dầu qua các giai đoạn tinh chế
Các giai đoạn
Dầu thô C1 Dầu thô C2m
m (g) (x ± SD) C (%) (x ± SD) m (g) (x ± SD) C (%) (x ± SD) Ban đầu 100 1,81 100 0,45
Sau khi lắc với nước -- -- -- --
Sau khi trung hòa acid tự do 75,4 ±2,5 0,34±0,12 75 ±3,4 0,32±0,14 Sau khi khử màu
(than hoạt tính)
-- -- -- --
Sau khi loại sáp
(để lắng trong điều kiện thường)
62,2±3,0 0,34±0,11 67 ±3,2 0,34±0,12
Sau khi khử mùi (ở nhiệt độ 2400C, 5 phút)
58,1 ± 2,8 0,37±0,14 63,3 ± 2,6 0,19±0,13
Chỉ số xà phòng hóa (mgKOH/g) của dầu thô C1 sau tinh chế, dầu thô C2m sau tinh chế lần lượt là : 177±12, 170±15
m : khối lượng dầu cám xát (g)
C : hàm lượng γ-oryzanol trong dầu cám (%) (--) không tiến hành định lượng
Các mẫu dầu tinh chế thu được có màu vàng sáng, trong suốt ở điều kiện nhiệt độ thường. Thử đông trong 5,5h ở 150C, mẫu trong suốt.
37
Ngoài ra, đề tài tiến hành thử nghiệm tinh chế dầu thô bỏ qua giai đoạn loại acid béo tự do, kết quả thu được như sau :
Bảng 3.7. Khối lƣợng dầu còn lại và hàm lƣợng γ-oryzanol trong dầu tinh chế không qua giai đoạn loại acid tự do
Các giai đoạn Dầu thô C1 m(g) (x± SD) C (%) (x ± SD)
Sau khi ban đầu 100 1,71
Sau khi lắc với nước 98± 2,5 2,02±0,04 Sau khi hử màu
(than hoạt tính)
95,2± 2,1 1,22±0,08
Sau khi loại sáp (để lắng trong điều kiện
thường, 1 tháng)
81,8± 1,4 1,20±0,07
Sau khi khử mùi (ở nhiệt độ 2400C, 5 phút)
81,1± 1,2 1,20±0,05
Chỉ số acid (mgKOH/g) và chỉ số xà phòng hóa (mgKOH/100g) của mẫu được xác định lần lượt là : 2±0,5 và 187±11
m : khối lượng dầu cám xát (g)
C : hàm lượng γ-oryzanol trong dầu cám (%)
Mục đích của tinh chế này tạo ra dầu cám gạo có hàm lượng cao γ-oryzanol dùng làm nguyên liệu mỹ phẩm.
Từ các thông số đã khảo sát, đề tài xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế như sau :
- Quy trình chiết xuất và tinh chế dầu cám gạo làm thực phẩm Nguyên liệu : cám C2m
38 Dung môi : n-hexan- ethanol (9 :1)
Phương pháp chiết : ngâm có khuấy đảo ở nhiệt độ thường, thời gian 7 ngày, Lần 1 : tỷ lệ dung môi/nguyên liệu : 5/1, 3 ngày
Lần 2 : tỷ lệ dung môi/nguyên liệu : 2,5/1, 2 ngày Lần 3 : tỷ lệ dung môi/nguyên liệu : 2,5/1, 2 ngày Tinh chế dầu thô theo quy trình có loại acid béo tự do.
Dầu thô
Loại gôm
Nước nóng Phospholipid,
lipoprotein
Dầu tinh chế Loại acid béo tự do
Tẩy màu Loại sáp Loại mùi Dung dịch NaOH Than hoạt tính Xà phòng Dầu thô Dầu tinh chế Để lắng, điều kiện thường, 1 tháng Nhiệt độ 2500 C, 5 phút
39
Thực nghiệm quy trình với cỡ mẫu 500g, 3 lần thu được kết quả sau :
Chỉ tiêu Kết quả
Hàm lượng dầu thô chiết được (%) 14,2 ± 0,07 Hàm lượng dầu tinh chế được (%) 10,8 ±0,03 Hàm lượng γ-oryzanol trong dầu tinh chế (%) 0,12 ± 0,02
Độ acid <1
- Quy trình chiết xuất và tinh chế dầu cám gạo làm mỹ phẩm, nguyên liệu tinh chế γ-oryzanol.
Nguyên liệu : cám C1
Dung môi : n-hexan- ethanol (9 :1)
Phương pháp chiết : chiết nóng ở nhiệt độ 700C, trong 60 phút, chiết 3 lần với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu : 5/1, 2,5/1, 2/1.
Tinh chế dầu theo quy trình không loại acid béo tự do. Dầu thô Loại gôm Nước nóng Phospholipid, lipoprotein Dầu tinh chế Tẩy màu Loại sáp Loại mùi Than hoạt tính Dầu thô Dầu thô
40
Thực hiện quy trình với cỡ mẫu 500g, lặp lại 3 lần, thu được kết quả như sau :
Chỉ tiêu Kết quả
Lượng dầu thô chiết được (%) 16,8 ± 0,07 Lượng dầu tinh chế được (%) 12,1 ± 0,05 Hàm lượng γ-oryzanol trong dầu tinh chế
(%)
1,1 ± 0,04
Chỉ số xà phòng hóa (mgKOH/100g) 180 ±14
3.2. Khảo sát đƣợc hàm lƣợng dầu và γ-oryzanol của một số giống lúa ở Việt Nam Việt Nam
Các mẫu lúa lấy tại An Giang đã được định rõ tên giống lúa, thời gian thu hoạch vụ đông xuân 2015. Tất cả các mẫu được chuẩn bị như mục 2.1.1.Tiến hành xác định hàm ẩm, hàm lượng dầu, hàm lượng γ-oryzanol trong dầu, hàm lượng γ-oryzanol trong cám, hàm lượng dầu trong cám. Kết quả như sau:
Bảng 3.8. Kết quả đánh giá một số mẫu lúa ở Việt Nam
Tên Độ ẩm gạo nguyên cám (%) (x ± SD) Hàm lượng dầu/gạo nguyên cám(%) ( x ± SD) Hàm lượng γ-oryzanol/ dầu cám (%) (x ± SD) Hàm lượng γ- oryzanol /gạo nguyên cám (mg/100g) (x ± SD) Hàm lượng dầu/cám ước lượng(%) ( x ± SD) AG1 10,20±0,03 1,78±0,17 2,57±0,04 45,75±0,50 14,24±1,44 AG2 10,57±0,03 2,84±0,25 1,97±0,04 55,95±0,61 22,72±1,20 AG3 11,07±0,07 3,53±0,18 2,07±0,09 64,79±0,70 28,24±1,28 AG4 11,00±0,05 2,82±0,24 1,78±0,02 50,02±0,49 22,56±1,6 AG5 11.08±0,06 2,68±0,19 1,62±0,01 43,42±0,34 21,44±1,12 SL 11,50±0,05 1,08± 0,19 1,53±0,01 16.52±0,30 8,64±1,12 TT1 10,00±0,07 2.51±0,29 1,13±0,02 28,36±0,38 20,08±1,04 TT2 11,10±0,04 2,81±0,21 1,47±0,04 41,31 ±0,43 22,48±1,20
41
(Hàm lượng dầu/cám ước lượng dựa trên tỷ lệ trung bình giữa vỏ cám: gạo là 1:7. Do đó: hàm lượng dầu/cám = hàm lượng dầu/gạo nguyên cám X 8)
Từ kết quả trên ta thấy, AG3 (IR504) có hàm lượng dầu cũng như hàm lượng γ-oryzanol/dầu, hàm lượng γ-oryzanol/gạo nguyên cám là lớn nhất. Theo thống kể của Sở Nông nghiệp An Giang, giống IR504 có diện tích canh tác và sản lượng lớn (26%).
Hai mẫu SL và TT1 hiện được bán phố biến trên thị trường dưới dạng gạo nguyên cám gắn với nhiều công dụng tốt cho sức khỏe, tuy nhiên kết quả hàm lượng γ-oryzanol (chất có nhiều tác dụng sinh học, và chỉ được tìm thấy duy nhất trong cám gạo) trong 2 mẫu gạo nguyên hạt trên lại thấp đáng kế. Kết quả này phù hợp với các kết quả công bố trước đây về hàm lượng γ-oryzanol trong một số giống gạo tím và gạo đỏ ở Hàn Quốc.
Mẫu TT1 và TT2 thu mua tại chợ địa phương, trong tình trạng đã bóc vỏ trấu, và không xác định thời gian xay xát và điều kiện bảo quản. Mặc dù hàm lượng dầu là tương đương với các mẫu AG1†5, tuy nhiên hàm lượng γ-oryzanol lại thấp hơn đáng kể so với các mẫu trên. Kết quả này có thể liên quan đến việc gạo sau khi bóc trấu lâu ngày và bảo quản trong điều kiện không tốt làm giảm chất lượng của lớp vỏ cám.
3.3. Xây dựng chỉ tiêu chất lượng dầu cám gạo
Từ các kết quả đạt được, đề tài dự kiến tiêu chuẩn cho 2 loại dầu cám gạo: - Chỉ tiêu chất lượng dầu cám gạo thực phẩm
Bảng 3.9. Chỉ tiêu chất lƣợng dầu cám thực phẩm
Chỉ tiêu Phương pháp Yêu cầu
Màu sắc Cảm quan Vàng sáng
Mùi Cảm quan Dễ chịu
Tỷ trọng 0,0914-0,926
γ – oryzanol (min) UV-vis, λ=314nm 0,1%
42
Chỉ số acid (mgKOH/g) < 2
- Chỉ tiêu chất lượng dầu cám giàu γ-oryzanol làm nguyên liệu mỹ phẩm
Bảng 3.10.Chỉ tiêu chất lƣợng dầu cám giàu γ-oryzanol
Chỉ tiêu Phương pháp Yêu cầu
Màu sắc Cảm quan Vàng đậm
Mùi Cảm quan Dễ chịu
Tỷ trọng 0,0914-0,926
γ – oryzanol UV-vis, λ=314nm 1200mg
Thử đông 5,5h 150C Trong suốt
Chỉ số xà phòng hóa 165-189
Chƣơng 4. BÀN LUẬN
43
- Lựa chọn nguyên liệu :
Trong dây truyền xay xát lúa gạo tạo ra 2 loại cám : cám xát (cám bóc tách từ lớp vỏ ngoài hạt gạo, có màu vàng đậm, thành phần gồm có cám, vỏ trấu, và 1 phần tấm) cám xoa (là cám sinh ra trong quá trình đánh bóng gạo, thành phần gồm những hạt cám mịn màu vàng sáng, tấm và một phần mầm gạo). Tuy nhiên, qua tìm hiều nhóm thực hiện đề tài chưa thấy nghiên cứu nào đề cập đến 2 loại cám trong đối tượng nghiên cứu.Đề tài đã chỉ ra được sự khác biệt rõ rệt giữa 2 loại cám này : cám xát chứa hàm lượng dầu và γ-oryzanol cao gấp 3-4 lần so với cám xoa. Việc tách cám mịn ra khỏi cám xoa bằng cách rây qua rây 180µm và xác định được hàm lượng dầu trong cám mịn tương đương với cám xát, tuy nhiên hàm lượng γ-oryzanol vẫn chỉ bằng 1/3 so với cám xát. Do đó, nhóm thực hiện đưa ra dự đoán γ-oryzanol tập trung chủ yếu ở lớp vỏ quả và vỏ hạt gạo, dầu gạo phân bố đều trên toàn bộ các lớp vỏ cám. Vì vậy, có thể nghĩ tới phương pháp sử dụng cám xát làm nguyên liệu cho chiết xuất γ-oryzanol, cám xoa làm nguyên liệu chiết dầu sử dụng làm thực phẩm.
Cám gạo ngay sau khi xay xát đã có hàm lượng acid béo tự do từ 1-3%, và liên tục tăng trong quá trình bào quản do sự phân hủy của enzym lipase, dẫn tới hàm lượng acid béo tự do trong dầu thô cám gạo rất cao. Lượng acid béo tự do cao ảnh hưởng đến quá trình tinh chế dầu cám gạo, làm mất đi hầu hết γ- oryzanol trong dầu tinh chế (>95%). Vì vậy, cần có biện pháp xử lý hạt thóc saut hu hoạch để bất hoạt enzym lipaze, để giảm tối thiếu lượng acid béo tự do trong dầu thô, từ đó làm tăng hàm lượng γ-oryzanol trong dầu tinh chế, cũng như là chi phí trong quá trình tinh chế, hạ giá thành sản phẩm.