c. Nhận xét đối với từng sinh viện tham gia thực hiên đề tài (ghi rõ từng nộ
3.3.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein thô
Protein thô được coi là giá trị Nitơ tổng số nhân với hệ số protein (Hàm lượng nitơ có trong protein).
Với hầu hết các loại thức ăn thì hệ số protein là 6,25 (16%) thích hợp với tất cả các loại thức ăn xanh. Vì vậy xác định hàm lượng protein thô chính là xác định hàm lượng Nitơ tổng.
Có nhiều cách xác định Nitơ tổng trong thức ăn. Phương pháp phổ biến nhất là phương pháp Kjeldahl.
Phương pháp Kjeldahl là phương pháp tiêu chuẩn để xác định hàm lượng nitơ, được phát triển từ thế kỷ XVIII.
Phương pháp gồm 3 bước:
-Mẫu được vô cơ hóa bằng acid sulfuric đun nóng với sự có mặt chất xúc tác. Nitơ trong mẫu được vô cơ hóa thành NH3.
-NH3 phản ứng với H2SO4 thành (NH4)2SO4.
-(NH4)2SO4 tác dụng với base mạnh NaOH, NH3 được giải phóng khỏi dung dịch acid. Sau đó giữ NH3 lại bằng acid boric. Đem dung dịch chuẩn độ bằng H2SO4 0,1N ta sẽ xác định được lượng NH3.
Các phản ứng trong quá trình:
Ví dụ: Với amino acid Glysin (NH2-CH2-COOH)
2NH2+ H2SO4 (NH4)2SO4
(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O NH3 + H3BO3 NH4H2BO3
NH4H2BO3 + H2SO4 H3BO3 + (NH4)2SO4
Protein thô = N tổng số*6,25
Có thể dùng nhiều loại chất xúc tác trong quá trình vô cơ hóa như: KMnO4, KClO4, H2O2
Công phá bằng H2SO4 đậm đặc có kim loại Se và H2O2 làm xúc tác thì cơ chế oxy hóa xảy ra như sau:
H2SO4 SO2 + H2O + [O] H2O2 H2O + [O]
[O] được sinh ra khi phân hủy H2SO4 và H2O2 sẽ oxy hóa các hợp chất hữu cơ thành CO2, H2O và NH3. NH3 phản ứng ngay với H2SO4. Phản ứng xảy ra như sau:
NH2-CH2-COOH + 3[O] 2CO2 + NH3 + H2O 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4
Vai trò của Se trong quá trình công phá là nâng cao nhiệt độ sôi của H2SO4, tăng cường quá trình tự giải, phân hủy và oxy hóa hợp chất hữu cơ.
Se sau khi bị H2SO4 oxy hóa sẽ thành tác nhân cho [O] theo các phản ứng sau:
2H2SO4 + Se SO2 + H2SeO3 + H2O H2SeO3 SeO2 + H2O
SeO2 Se + 2[O]
[O] được sinh ra lần nữa lại tác động tương hỗ với H2SO4 và cứ thế quá trình được lặp lại. Thời gian công phá từ 2 giờ đến 5 giờ (đến khi nào mẫu trở trên trong suốt). Dùng 7 ml H2SO4 cho 0,1 gam mẫu.
Quy trình phân tích: -Cân mẫu:
Cân 0,1 gam mẫu đã sấy khô (W) vào bình Kjeldahl 50 ml. Cho một ít chất xúc tác, tiếp theo cho 7 ml H2SO4 đậm đặc. Đậy miệng lại bằng giấy bạc và ủ trong 12 giờ. Tiếp đến cho 3 ml H2O2 để yên vài phút.
-Giai đoạn 1: Công phá mẫu
Đặt những bình Kjeldahl đã chuẩn bị mẫu lên bếp điện đặt trong tủ hút. Chờ khoảng 2 đến 5 giờ. Đến khi mẫu chuyển sang trong suốt là được.
Giai đoạn 2: Chưng cất
Dùng pipet hút 10 ml acid boric 2% vào erlen 100 ml. Đặt vào ống ngưng của hệ thống chưng cất (để ống ngưng ngập trong acid boric).
Chuyển mẫu từ bình Kjeldahl vào ống chưng cất và tráng bình Kjeldahl vài lần bằng nước cất cho vào ống chưng cất (ống Kjeldahl). Cho chất chỉ thị Phenolphtalein vào ống chưng cất và lắp hệ thống chưng cất hoàn lưu.
Cho từ từ đến 20 ml NaOH 33% vào ống chưng cất .
Bật hệ thống chưng cất và mở vòi nước hoàn lưu.
Thấy erlen chứa acid boric từ màu hồng tím chuyển sang màu xanh lam. Chưng cất đến khi mực thể tích đạt 80 ml thì tắt hệ thống, chờ nước trong ống khí vừa xuống hết và lấy bình chưng cất chứa mẫu ra và lấy erlen ra.
- Giai đoạn 3: Chuẩn độ
Dùng H2SO4 0,1N để chuẩn độ đến khi màu xanh chuyển sang màu hồng tím. Ghi nhận thể tích H2SO4.
- Kết quả quả được tính như sau:
Hàm lượng Nitơ tổng số được tính theo công thức:
N W n V V N(%) ( ')* *0,014*100
N%: Tỉ lệ phần trăm Nitơ có trong mẫu.
V: Thể tích H2SO4 dùng cho phân định phần mẫu (ml). n: Nồng độ đương lượng của dd H2SO4 (n = 0,1N). W: Trọng lượng mẫu (gam).
0,014: Hệ số tính ra N.
Hàm lượng protein thô được tính như sau: %CP = N % * 6,25
H2SO4 và NaOH có thể gây bỏng da nên phải mang bao tay khi sử dụng.
Pha hóa chất và phá mẫu trong tủ hút để tránh khí độc.