Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein thô

c. Nhận xét đối với từng sinh viện tham gia thực hiên đề tài (ghi rõ từng nộ

3.3.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein thô

Protein thô được coi là giá trị Nitơ tổng số nhân với hệ số protein (Hàm lượng nitơ có trong protein).

Với hầu hết các loại thức ăn thì hệ số protein là 6,25 (16%) thích hợp với tất cả các loại thức ăn xanh. Vì vậy xác định hàm lượng protein thô chính là xác định hàm lượng Nitơ tổng.

Có nhiều cách xác định Nitơ tổng trong thức ăn. Phương pháp phổ biến nhất là phương pháp Kjeldahl.

Phương pháp Kjeldahl là phương pháp tiêu chuẩn để xác định hàm lượng nitơ, được phát triển từ thế kỷ XVIII.

Phương pháp gồm 3 bước:

-Mẫu được vô cơ hóa bằng acid sulfuric đun nóng với sự có mặt chất xúc tác. Nitơ trong mẫu được vô cơ hóa thành NH₃.

-NH₃ phản ứng với H₂SO₄ thành (NH₄)₂SO₄.

-(NH₄)₂SO₄ tác dụng với base mạnh NaOH, NH₃ được giải phóng khỏi dung dịch acid. Sau đó giữ NH₃ lại bằng acid boric. Đem dung dịch chuẩn độ bằng H₂SO₄ 0,1N ta sẽ xác định được lượng NH₃.

Các phản ứng trong quá trình:

Ví dụ: Với amino acid Glysin (NH₂-CH₂-COOH)

2NH₂+ H₂SO₄ (NH₄)₂SO₄

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH  2NH₃ + Na₂SO₄ + 2H₂O NH₃ + H₃BO₃ NH₄H₂BO₃

NH₄H₂BO₃ + H₂SO₄ H₃BO₃ + (NH₄)₂SO₄

Protein thô = N tổng số*6,25

Có thể dùng nhiều loại chất xúc tác trong quá trình vô cơ hóa như: KMnO₄, KClO₄, H₂O₂

Công phá bằng H₂SO₄ đậm đặc có kim loại Se và H₂O₂ làm xúc tác thì cơ chế oxy hóa xảy ra như sau:

H₂SO₄  SO₂ + H₂O + [O] H₂O₂ H₂O + [O]

[O] được sinh ra khi phân hủy H₂SO₄ và H₂O₂ sẽ oxy hóa các hợp chất hữu cơ thành CO2, H₂O và NH₃. NH₃ phản ứng ngay với H₂SO₄. Phản ứng xảy ra như sau:

NH₂-CH₂-COOH + 3[O]  2CO₂ + NH₃ + H₂O 2NH₃ + H₂SO₄  (NH₄)₂SO₄

Vai trò của Se trong quá trình công phá là nâng cao nhiệt độ sôi của H₂SO₄, tăng cường quá trình tự giải, phân hủy và oxy hóa hợp chất hữu cơ.

Se sau khi bị H₂SO₄ oxy hóa sẽ thành tác nhân cho [O] theo các phản ứng sau:

2H₂SO₄ + Se  SO₂ + H₂SeO₃ + H₂O H₂SeO₃ SeO₂ + H₂O

SeO₂ Se + 2[O]

[O] được sinh ra lần nữa lại tác động tương hỗ với H2SO₄ và cứ thế quá trình được lặp lại. Thời gian công phá từ 2 giờ đến 5 giờ (đến khi nào mẫu trở trên trong suốt). Dùng 7 ml H2SO₄ cho 0,1 gam mẫu.

Quy trình phân tích: -Cân mẫu:

Cân 0,1 gam mẫu đã sấy khô (W) vào bình Kjeldahl 50 ml. Cho một ít chất xúc tác, tiếp theo cho 7 ml H₂SO₄ đậm đặc. Đậy miệng lại bằng giấy bạc và ủ trong 12 giờ. Tiếp đến cho 3 ml H₂O₂ để yên vài phút.

-Giai đoạn 1: Công phá mẫu

Đặt những bình Kjeldahl đã chuẩn bị mẫu lên bếp điện đặt trong tủ hút. Chờ khoảng 2 đến 5 giờ. Đến khi mẫu chuyển sang trong suốt là được.

Giai đoạn 2: Chưng cất

 Dùng pipet hút 10 ml acid boric 2% vào erlen 100 ml. Đặt vào ống ngưng của hệ thống chưng cất (để ống ngưng ngập trong acid boric).

 Chuyển mẫu từ bình Kjeldahl vào ống chưng cất và tráng bình Kjeldahl vài lần bằng nước cất cho vào ống chưng cất (ống Kjeldahl). Cho chất chỉ thị Phenolphtalein vào ống chưng cất và lắp hệ thống chưng cất hoàn lưu.

 Cho từ từ đến 20 ml NaOH 33% vào ống chưng cất .

 Bật hệ thống chưng cất và mở vòi nước hoàn lưu.

 Thấy erlen chứa acid boric từ màu hồng tím chuyển sang màu xanh lam. Chưng cất đến khi mực thể tích đạt 80 ml thì tắt hệ thống, chờ nước trong ống khí vừa xuống hết và lấy bình chưng cất chứa mẫu ra và lấy erlen ra.

- Giai đoạn 3: Chuẩn độ

Dùng H₂SO₄ 0,1N để chuẩn độ đến khi màu xanh chuyển sang màu hồng tím. Ghi nhận thể tích H₂SO₄.

- Kết quả quả được tính như sau:

Hàm lượng Nitơ tổng số được tính theo công thức:

N W n V V N(%) ^{(  ')* *0,014}*100

N%: Tỉ lệ phần trăm Nitơ có trong mẫu.

V: Thể tích H₂SO₄ dùng cho phân định phần mẫu (ml). n: Nồng độ đương lượng của dd H₂SO₄ (n = 0,1N). W: Trọng lượng mẫu (gam).

0,014: Hệ số tính ra N.

Hàm lượng protein thô được tính như sau: %CP = N % * 6,25

 H₂SO₄ và NaOH có thể gây bỏng da nên phải mang bao tay khi sử dụng.

 Pha hóa chất và phá mẫu trong tủ hút để tránh khí độc.