Tiến hành thí nghiệm

c. Nhận xét đối với từng sinh viện tham gia thực hiên đề tài (ghi rõ từng nộ

3.3 Tiến hành thí nghiệm

3.3.1 Quy trình tiến hành Sơ đồ khái quát quy trình:

Hình 3. 2 Sơ đồ quy trình phân tích mẫu

DM Ash CP CF EE ADF NDF

NGHIỀN MỊN

ĐẬU RỒNG HOANG/ĐẬU BIẾC

SẤY 60–65

Giai đoạn chuận bị mẫu thực hiện quy trình phân tích

Hình 3.3 Các giai đoạn xử lý mẫu

PHƠI MẪU MẪU ĐƢỢC NGHIỀN MỊN SẤY MẪU PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU TPHH MẪU ĐƢỢC CẮT NHỎ MẪU CHUÂN BỊ THU HOẠCH THU HOẠCH MẪU

3.2.2 Xác định hàm lƣợng vật chất khô (DM) 3.2.2.1 Xác định hàm lƣợng nƣớc ban đầu 3.2.2.1 Xác định hàm lƣợng nƣớc ban đầu

Chuẩn bị: Mẫu trước khi sấy phải được nghiền sơ bộ. Cỏ, rơm, rau, củ, quả trước khi sấy phải thái nhỏ từ 1–2 cm.

Quy trình: Sấy khay nhôm ở nhiệt độ 90–100^oC trong 30 phút, để nguội trong không khí và cân chính xác đến 0,01 g. Tùy thuộc vào lượng nước trong thức ăn mà lấy mẫu, cân khoảng 100–500 g mẫu cho vào khay nhôm.

Cho mẫu vào tủ sấy và ở nhiệt độ 60–65^oC, sấy trong vòng 6–8 giờ và có thể sấy lâu hơn nếu mẫu nhiều nước, thường xuyên kiểm tra và đảo mẫu được bốc hơi đều. Sau khi sấy, lấy khay ra, để nguội trong không khí, đem cân. Lại cho khay đựng mẫu vào tủ sấy và sấy cho đên khi khối lượng giữa hai lần cân liêu tiếp không chênh lệch nhau quá 0,5 g.

3.2.2.2 Xác định hàm lƣợng nƣớc ở trạng thái gần khô

- Xác định trọng lượng vật chứa: Chén sứ. - Đánh số và tráng chén sứ bằng nước cất. - Sấy ở 105^oC trong vòng 2 giờ.

- Đặt chén vào bình hút ẩm và cân ngay có trọng lượng P₁.

Sấy tiếp 30 phút ở 105oC. Đặt chén vào bình hút ẩm và cân lần hai có trọng lượng P₂. Nếu P₁ – P₂ ≤ 0,001g ta có trọng lượng chén sứ là P₂.

Cân mẫu:

-Cân khoảng 1 g mẫu (W) cho vào chén sứ (đã biết P2).

-Sấy ở 105oC ít nhất 3–4 giờ. Cân chén và mẫu ta có trọng lượng P1’

. -Sấy tiếp 30 phút ở 105o

C. Cân lần hai ta có trọng lượng P₂^’. -Nếu P1’

– P₂^’ ≤ 0,005g ta có trọng lượng P2’của chén và mẫu ở trạng thái khô hoàn toàn.

3.2.2.3 Tính toán kết quả

- Hàm lượng nước ban đầu h₁ (%):

h₁ = 100 1 2 1 ^  M M M

M₂: khối lượng mẫu sau khi sấy ở 65C (g). -Hàm lượng nước còn lại h₂ (%):

h₂ (%) = ⁽ 2⁾ 100 ' 2^   W P P W

Trong đó: W: khối lượng mẫu (g).

P₂^’: khối lượng mẫu và chén sứ sau khi sấy (g). P₂: khối lượng chén sứ (g).

-Hàm lượng nước toàn phần (%):

 

3.3.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein thô

Protein thô được coi là giá trị Nitơ tổng số nhân với hệ số protein (Hàm lượng nitơ có trong protein).

Với hầu hết các loại thức ăn thì hệ số protein là 6,25 (16%) thích hợp với tất cả các loại thức ăn xanh. Vì vậy xác định hàm lượng protein thô chính là xác định hàm lượng Nitơ tổng.

Có nhiều cách xác định Nitơ tổng trong thức ăn. Phương pháp phổ biến nhất là phương pháp Kjeldahl.

Phương pháp Kjeldahl là phương pháp tiêu chuẩn để xác định hàm lượng nitơ, được phát triển từ thế kỷ XVIII.

Phương pháp gồm 3 bước:

-Mẫu được vô cơ hóa bằng acid sulfuric đun nóng với sự có mặt chất xúc tác. Nitơ trong mẫu được vô cơ hóa thành NH₃.

-NH₃ phản ứng với H₂SO₄ thành (NH₄)₂SO₄.

-(NH₄)₂SO₄ tác dụng với base mạnh NaOH, NH₃ được giải phóng khỏi dung dịch acid. Sau đó giữ NH₃ lại bằng acid boric. Đem dung dịch chuẩn độ bằng H₂SO₄ 0,1N ta sẽ xác định được lượng NH₃.

Các phản ứng trong quá trình:

Ví dụ: Với amino acid Glysin (NH₂-CH₂-COOH)

2NH₂+ H₂SO₄ (NH₄)₂SO₄

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH  2NH₃ + Na₂SO₄ + 2H₂O NH₃ + H₃BO₃ NH₄H₂BO₃

NH₄H₂BO₃ + H₂SO₄ H₃BO₃ + (NH₄)₂SO₄

Protein thô = N tổng số*6,25

Có thể dùng nhiều loại chất xúc tác trong quá trình vô cơ hóa như: KMnO₄, KClO₄, H₂O₂

Công phá bằng H₂SO₄ đậm đặc có kim loại Se và H₂O₂ làm xúc tác thì cơ chế oxy hóa xảy ra như sau:

H₂SO₄  SO₂ + H₂O + [O] H₂O₂ H₂O + [O]

[O] được sinh ra khi phân hủy H₂SO₄ và H₂O₂ sẽ oxy hóa các hợp chất hữu cơ thành CO2, H₂O và NH₃. NH₃ phản ứng ngay với H₂SO₄. Phản ứng xảy ra như sau:

NH₂-CH₂-COOH + 3[O]  2CO₂ + NH₃ + H₂O 2NH₃ + H₂SO₄  (NH₄)₂SO₄

Vai trò của Se trong quá trình công phá là nâng cao nhiệt độ sôi của H₂SO₄, tăng cường quá trình tự giải, phân hủy và oxy hóa hợp chất hữu cơ.

Se sau khi bị H₂SO₄ oxy hóa sẽ thành tác nhân cho [O] theo các phản ứng sau:

2H₂SO₄ + Se  SO₂ + H₂SeO₃ + H₂O H₂SeO₃ SeO₂ + H₂O

SeO₂ Se + 2[O]

[O] được sinh ra lần nữa lại tác động tương hỗ với H2SO₄ và cứ thế quá trình được lặp lại. Thời gian công phá từ 2 giờ đến 5 giờ (đến khi nào mẫu trở trên trong suốt). Dùng 7 ml H2SO₄ cho 0,1 gam mẫu.

Quy trình phân tích: -Cân mẫu:

Cân 0,1 gam mẫu đã sấy khô (W) vào bình Kjeldahl 50 ml. Cho một ít chất xúc tác, tiếp theo cho 7 ml H₂SO₄ đậm đặc. Đậy miệng lại bằng giấy bạc và ủ trong 12 giờ. Tiếp đến cho 3 ml H₂O₂ để yên vài phút.

-Giai đoạn 1: Công phá mẫu

Đặt những bình Kjeldahl đã chuẩn bị mẫu lên bếp điện đặt trong tủ hút. Chờ khoảng 2 đến 5 giờ. Đến khi mẫu chuyển sang trong suốt là được.

Giai đoạn 2: Chưng cất

 Dùng pipet hút 10 ml acid boric 2% vào erlen 100 ml. Đặt vào ống ngưng của hệ thống chưng cất (để ống ngưng ngập trong acid boric).

 Chuyển mẫu từ bình Kjeldahl vào ống chưng cất và tráng bình Kjeldahl vài lần bằng nước cất cho vào ống chưng cất (ống Kjeldahl). Cho chất chỉ thị Phenolphtalein vào ống chưng cất và lắp hệ thống chưng cất hoàn lưu.

 Cho từ từ đến 20 ml NaOH 33% vào ống chưng cất .

 Bật hệ thống chưng cất và mở vòi nước hoàn lưu.

 Thấy erlen chứa acid boric từ màu hồng tím chuyển sang màu xanh lam. Chưng cất đến khi mực thể tích đạt 80 ml thì tắt hệ thống, chờ nước trong ống khí vừa xuống hết và lấy bình chưng cất chứa mẫu ra và lấy erlen ra.

- Giai đoạn 3: Chuẩn độ

Dùng H₂SO₄ 0,1N để chuẩn độ đến khi màu xanh chuyển sang màu hồng tím. Ghi nhận thể tích H₂SO₄.

- Kết quả quả được tính như sau:

Hàm lượng Nitơ tổng số được tính theo công thức:

N W n V V N(%) ^{(  ')* *0,014}*100

N%: Tỉ lệ phần trăm Nitơ có trong mẫu.

V: Thể tích H₂SO₄ dùng cho phân định phần mẫu (ml). n: Nồng độ đương lượng của dd H₂SO₄ (n = 0,1N). W: Trọng lượng mẫu (gam).

0,014: Hệ số tính ra N.

Hàm lượng protein thô được tính như sau: %CP = N % * 6,25

 H₂SO₄ và NaOH có thể gây bỏng da nên phải mang bao tay khi sử dụng.

 Pha hóa chất và phá mẫu trong tủ hút để tránh khí độc.

3.3.4 Xác định hàm lƣợng xơ thô

Là thành phần còn lại sau khi thủy phân mẫu thức ăn liên tục với acid và base mạnh.

Tùy theo loài mà khả năng tiêu hóa xơ thô khác nhau. Đối với gia súc nhai lại có khả năng tiêu hóa xơ thô từ 50–90%.

Mẫu thức ăn nghiền nhỏ được xử lý lần lượt bằng acid và base loãng được đun nóng. Sau đó rửa bằng acetone hoặc ether.

H₂SO₄ thủy phân các chất hoàn tan trong acid như carbohydrat, biến nó thành đường đơn, ngoài ra một phần protein cũng bị hòa tan.

Base thủy phần chất béo biến thành xà phòng và glycerin, hòa tan toàn bộ protein.

Acid và base có thể hòa tan được một phần khoáng.

Ether và cồn dùng để hòa tan những chất hữu cơ tan trong dung môi như các chất và chất béo còn lại.

Sau khi xử lý đem nung, trọng lượng phần đã mất đi là xơ thô. Quy trình phân tích:

-Cân khoảng 0,5 gam mẫu vào beacher 250 ml, Cho vào 100 ml H₂SO₄ 0,765N. Đun sôi khoảng 10 phút (kể từ thời điểm sôi). Lọc bằng cốc lọc.

-Rửa cặn bằng 100 ml NaOH 0,636N. Đun sôi trong 10 phút. Lọc bằng cốc lọc.

-Rửa nhiều lần bằng nước cất đun sôi đến khi hết NaOH (kiểm tra giọt nước đọng dưới phễu không còn nhờn là được) và rửa lại bằng aceton.

-Sấy mẫu: Cho cốc lọc có chứa mẫu vào tủ sấy và sấy ở 105oC trong 3–4 giờ sau đó đem cân. Sau 30 phút cân tiếp lần hai nếu hai lần chênh lệch không quá 0,005 g là được. Khi đó ta có trọng lượng P_S.

-Đặt cốc lọc sau khi xử lý vào lò nung, điều chỉnh nhiệt độ ở 500oC và nung trong 3 giờ, tắt lò nung và để nguội sau đó đem sản phẩm qua tủ sấy sấy ở 105o

C trong 1–2 giờ, cần sản phẩm. Sau 30 phút cân lại lần 2, hai lần cân sai số không quá 0,005 g là được. Khi đó ta có trọng lượng P_n.

Tính kết quả:

Trong đó: P_S: Trọng lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g). P_n: Trọng lượng cốc và mẫu sau khi nung (g). W: Trọng lượng mẫu (g).

3.3.5 Xác định hàm lƣợng khoáng tổng số 3.3.5.1 Nguyên lý 3.3.5.1 Nguyên lý

Mẫu thức ăn được thiêu cháy trong tủ nung ở nhiệt độ 550–600oC. Chất hữu cơ được đốt cháy hoàn toàn còn lại phần tro thô (Khoáng toàn phần). Ở nhiệt độ cao hơn sẽ bị hao hụt Na, K, S, P. Ở nhiệt độ thấp hơn 4500

C thì Carbon sẽ không bị đốt hoàn toàn thành CO2.

Tro thô (Khoáng toàn phần) là hàm lượng chất vô cơ còn lại sau khi các chất hữu cơ bị đốt cháy hết.

3.3.5.2 Quy trình phân tích

- Xác định trọng lượng cốc nung.

- Đánh số cốc nung bằng dung dịch clorua sắt (III) và tráng bằng nước cất.

- Sấy trong tủ sấy ở 105^oC khoảng 2 giờ, sau đó đem cân nhanh. Tiếp tục sấy lần 2.

- Cân trọng lượng P₁ (những cốc không thay đổi khối lượng). - Nung mẫu

 Cân 1 gam mẫu ở trạng thái khô (W) vào cốc nung đã cân khối lượng.

 Sấy mẫu ở 100^oC trong 3 giờ.

 Đem mẫu vào tủ nung và nung ở 550^oC trong 2 giờ, để nguội trong lò đến ngày hôm sau. Đem mẫu ra và sấy trong tủ sấy trong 60 phút ở nhiệt độ 105^oC, cân lần 1. Sấy tiếp tục ở 105^oC trong 30 phút, cân lại lần 2 nếu hai lần cân có sai số không quá 0,005 g là được. Ta có trọng lượng P2.

- Tính kết quả:

% Khoáng tổng số = 2 1 *100

W

P P 

P₁: Trọng lượng cốc ban đầu (g).

P₂: Trọng lượng cốc và mẫu sau khi nung (g). W: Trọng lượng mẫu ban đầu (g).

3.3.6 Xác định hàm lƣợng xơ trung tính (NDF) 3.3.6.1 Khái niệm 3.3.6.1 Khái niệm

- NDF (Neatraldetergentinsolublefibre): là phần còn lại sau khi chiết xuất trong dung dịch Sodium lauryl sulphate và Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Thành phần bao gồm các thành phần chất xơ như: hemicellulose, cellulose và lignin và có thể dùng để đo lượng thành phần của vách tế bào thực vật.

- NDF được xem như xơ tổng số cả thức ăn. 3.3.6.2 Nguyên tắc

- Dung dịch chất tẩy trung tính dùng để hòa tan protein. - Na₂SO₃ hỗ trợ việc hòa tan hợp chất nitơ.

- EDTA dùng để kết hợp với calcium và kim loại thải pectin ở nhiệt độ sôi.

- Triethylene glycol dùng để loại bỏ thành phần không phải chất xơ.

3.3.6.3 Quy trình phân tích

Cân 0,5 gam vào cốc ủ, cho vào 100 ml thuốc tẩy trung tính, đậy nắp bằng giấy bạc và cho vào tủ sấy và ở nhiệt độ 90oC và ủ trong 12 giờ.

Đủ thời gian đem cốc ra và lọc chân không với nước cất nóng đến hết bọt thì tráng lại bằng acetone.

Để bên ngoài khoảng 30 phút để acetone bay hơi rồi đem vào tủ sấy ở nhiệt độ 105oC và sấy trong 4 giờ. Cân và ghi nhận khối lượng được (P_S).

Tiếp tục nung mẫu trong tủ nung trong 3 giờ ở nhiệt độ 550o

C. Chờ nguội đến hôm sau thì lấy mẫu ra và tiếp tục sấy trong tủ sấy trong 1 giờ ở 105^oC. Cân lại cốc lần nữa được (P_n).

3.3.6.4 Tính kết quả

Trong đó: P_S: Trọng lượng cốc cân lần 1 (g). P_n: Trọng lượng cốc cân lần 2 (g). W: Trọng lượng mẫu (g).

3.3 .7 Xác định hàm lƣợng xơ tan trong acid (Acid Detergent Fibre-ADF) ADF)

3.3.7.1 Khái niệm

ADF (Acid dertergent insoluble fibre) là thành phần còn lại sau khi mẫu bị thủy phân với acid sulfuric (H₂SO₄ 0,5M và Cetyltrimethylamonium bromide, thành phần chủ yếu của ADF là lignin, các thành phần của cellulose trong thực vật và bao gồm silica.

3.3.7.2 Nguyên tắc

- Dung dịch thuốc tẩy acid dùng để hòa tan các chất trong vách tế bào như hemicelluloses và các chất khoáng không tan hòa trong cellulose.

- Các protein bị phá hủy.

- ADF chứa ligin thô và một phần cellulose trong đó có silica.

3.3.7.3 Quy trình phân tích

- Cân 0,5 gam vào cốc ủ, cho vào 100 ml thuốc tẩy trung tính, đậy nắp bằng giấy nhôm và cho vào tủ sấy và ở nhiệt độ 90o

C và ủ trong 12 giờ.

- Đủ thời gian đem cốc ra và lọc chân không với nước cất nóng đến hết bọt thì tráng lại bằng acetone.

- Để bên ngoài khoảng 30 phút để acetone bay hơi rồi đem vào tủ sấy ở nhiệt độ 105oC và sấy trong 4 giờ. Cân và ghi nhận khối lượng (P_S).

- Tiếp tục nung mẫu trong tủ nung trong 3 giờ ở nhiệt độ 550^oC. Chờ nguội đến hôm sau thì lấy mẫu ra và tiếp tục sấy trong tủ sấy trong 1 giờ ở 105^oC. Cân lại cốc lần nữa (P_n).

3.3.7.4 Tính kết quả

Trong đó: P_S: Trọng lượng cốc cân lần 1 (g). P_n: Trọng lượng cốc cân lần 2 (g). W: Trọng lượng mẫu (g).

3.4 Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý sơ bộ bằng phần mềm Excel, phân tích theo phân phối chuẩn T và General Linear Model của chương trình Minitab Professional 16.1.0.0.

Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Thí nghiệm 1: Khảo sát năng suất và thành phần hóa học của đậu Rồng hoang (Psophocarpus scandes), đậu Biếc (Clitoria ternatea) mọc tự nhiên tại thành phố Cần Thơ.

Bảng 4.1 Thành phần hóa học và năng suất của đậu Rồng hoang và đậu Biếc đƣợc khảo sát tại thành phố Cần Thơ.

Chỉ tiêu

Nghiệm thức

SE

M ^P

Đậu Biếc Đậu Rồng hoang NSX (tấn/ha/lứa) 4,96 ±2,28 5,58±3,32 0,74 0,01 NSX (tấn/ha/năm) 24,8±2,28 27,9±3,32 NSK (tấn/ha/lứa) 1,08±0,51 1,11±0,73 0,16 0,59 NSK (tấn/ha/năm) 5,41±0,51 5,54±0,73 NSCP (tấn/ha/lứa) 0,24±0,12 0,27±0,17 0,04 0,05 NSCP (tấn/ha/năm) 1,22±0,12 1,33±0,17 DM (%) 21,8±0,81 19,8±0,78 0,21 0,01 Ash (%) 8,66±0,63 9,56±0,99 0,21 0,01 CF (%) 27,1±0,76 26,5±0,87 0,21 0,07 CP (%) 22,5±0,91 24,0±1,00 0,25 0,01 ADF (%) 30,7±2,58 32,0±1,79 0,62 0,14 NDF (%) 40,6±1,53 41,9±1,06 0,34 0,01

Ghi chú: NSX: năng suất chất xanh, NSK: năng suất chất khô và NSCP: năng suất protein

Năng suất xanh (NSX) là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá hiệu quả khi trồng cây họ đậu. Số liệu bảng 4.1 cho thấy NSX ngoài tự nhiên của đậu Rồng hoang (27,9 tấn/ha/năm) cao hơn so với đậu Biếc (24,8 tấn/ha/năm) và sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê (P=0,01). Bên cạnh đó, NSX cao thì năng suất protein (NSCP) cũng cao, đậu Rồng hoang có NSCP là

1,33 tấn/ha/năm cao hơn đậu Biếc với 1,22 tấn/ha/năm. Trái lại, năng suất chất khô (NSK) của đậu Rồng hoang với đậu Biếc chênh lệch không nhiều với giá trị lần lượt là 5,54 và 5,41 tấn/ha/năm.

Kết quả năng suất đậu Biếc theo khảo sát của chúng tôi là (24,8 tấn/ha/năm) thấp hơn so với nghiên cứu của Agange et al. (2003) có năng suất là 30 tấn/ha/năm và nghiên cứu của Barro et al. (1983) có năng suất đạt 35 tấn/ha/năm là do thí nghiệm của Agange et al. (2003) và Barro et al. (1983) cây được trồng tại vùng có khí hậu ôn đới còn thí nghiệm của chúng tôi theo