PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu
3.2.2.7.đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo
* Môi Trường nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn Xanthomonas oryzae ựược nuôi cấy trên môi trường Wakimoto.
- Thành phần môi trường gồm: Khoai tây 300g; ựường saccarose 15g; pepton 5g; agar 17g; Na2HPO4.12H2O 2g; Ca2(NO3)2.4H2O 0.5G; nước cất 100ml; pH 6,8-7,0.
- Môi trường Wakimoto ựược hấp khử trùng ở nhiệt ựộ 121oC trong ống nghiệm thời gian 20 phút, tạo mặt thạch nghiêng.
- Trước khi lây nhiễm nguồn vi khuẩn ựược cấy bảo quản trong môi trường sữa ở -30oC, ựược cấy truyền sang môi trường Wakimoto ở 28oC sau 48- 72h tuổi, sau ựó pha loãng dung dịch vi khuẩn bằng nước cất vô trùng ựạt ựược nồng ựộ 108CPU/ml ựể lây bệnh.
* Phương pháp lây nhiễm
- Lây bệnh theo phương pháp cắt ựầu lá: Dùng kéo ựã khử trùng nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn gây bệnh bạc lá (mỗi chủng vi khuẩn dùng một kéo vô trùng) cắt lên ựầu lá lúa một ựoạn dài khoảng 2- 5cm và lây nhiễm vào giai ựoạn lúa làm ựòng- trỗ, mỗi chủng một cây, trên một cây cắt toàn bộ các lá xanh.
- Trước khi lây nhiễm, tiến hành làm thắ nghiệm ựể xác ựịnh khả năng duy trì ựộc tắnh của các chủng vi khuẩn trong quá trình bảo quản bằng cách lây thử trên dòng mẫn cảm IR24. Sau 5 ngày thấy ựầu lá héo xanh và tái ựi chứng tỏ các chủng vi khuẩn này có ựộc tắnh có thể dùng ựể lây nhiễm ựược.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 * đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá
- Sau khi lây nhiễm ựược 18 ngày tiến hành ựo chiều dài vết bệnh theo phương pháp do GS Satoru Taura ựề xuất.
- Dựa vào chiều dài của vết bệnh ựể ựánh giá tắnh kháng của các giống như sau:
+ Chiều dài vết bệnh<8cm: kháng bạc lá (R) + Chiều dài vết bệnh từ 8-12cm: Nhiễm vừa (M) + Chiều dài vết bệnh >12cm: Nhiễm nặng (S)
3.2.2.8. Xác ựịnh gen kháng Xa4, xa5, Xa7 bằng phản ứng PCR a) Chiết tách DNA
- Chọn những lá còn non, không bị sâu bệnh và cắt vào lúc sáng sớm ựể chiết tách DNA. Cho lá lúa vào túi ựựng mẫu và ựánh số thứ tự, sau ựó ựưa mẫu lá về phòng thắ nghiệm và ựặt trên ựá lạnh.
- Các cối sứ dùng ựể nghiền mẫu ựược rửa sạch và hấp khử trùng. Lá của mỗi giống lúa ựược cắt nhỏ, cho vào trong cối và ựặt trên ựá lạnh. Các cối sứ và ống eppendort ựược ựánh số thứ tự theo các giống.
- Nhỏ 400ộl dung dich chiết tách DNA vào trong cối sứ rồi lấy chày nghiền nhỏ các mẫu lá cho ựến khi dung dịch chiết tách chuyển sang màu xanh.
- Cho thêm 400ộl dung dịch chiết tách DNA vào trong cối rồi lấy chày nghiền nhỏ các mẫu lá cho ựến khi dung dịch chiết tách DNA chuyển sang màu xanh.
- Cho thêm 400ộl dung dịch chiết tách DNA vào trong cối sứ và trộn lẫn, sau ựó chuyển dung dịch trong cối sứ vào trong ống eppendort tương ứng ựã ựánh số thự tự ban ựầu
- Cho thêm 700ộl dung dịch phenol/chlorform/isoamyl với tỷ lệ 25:24:1 và trộn ựều rồi ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 7 phút.
- Tiếp tục chuyển phần dung dịch phắa trên sang ống eppendort mới ựã ựánh số thứ tự theo mỗi giống ựể nhằm loại bỏ kết tủa.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33 - đổ 600ộl ethanol trộn ựều sau ựó ựưa vào máy ly tâm với tốc ựộ 13000 vòng/phút ở 4oC trong 7 phút.
- Ly tâm xong ựổ phần dung dịch phắa trên, lấy phần kết tủa phắa dưới ựó chắnh là DNA cần chiết tách.
- Rửa kết tủa bằng ethanol 70% rồi làm khô tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng bằng cách úp ống nghiệm lên giấy thấm.
- Hoà tan phần DNA kết tủa bằng dung dịch TE với thể tắch 50ộl rồi bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ - 20oC hoặc 4oC.
Bảng 3.2. Thành phần dung dịch chiết tách Thành phần Nồng ựộ dd mẹ Nồng ựộ dd làm việc Hỗn hợp 10ml dd chiết tách Hỗn hợp 50ml dd chiết tách Tris-HCL pH=8 1M 50mM 0.5ml 2.5ml EDTA pH=8 0.5M 0.25 mM 0.5ml 2.5ml NaCl 5M 300 mM 0.6ml 3.0ml SDS 10% 1% 1ml 5.0ml H2O 7.4ml 37.0ml Bảng 3.3. Thành phần dung dịch TE Thành phần Nồng ựộ dd mẹ Nồng ựộ dd làm việc Thể tắch 50ml Tris-HCl 1M 10mM 0.5ml EDTA 0.5M 1mM 0.1ml H2O 49.4ml Cách pha dung dịch mẹ: + Dung dịch Tris-HCl 1M(PH=8)
Hoà tan 30,28g trisma Base (MW=121.1) trong 200ml nước cất sau ựó dùng HCl chỉnh pH=8 và chỉnh thể tắch tới 240ml bằng nước cất chứa 4g
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 NaOH khuấy mạnh bằng thanh khuấy, sau ựó dùng NaOH chỉnh pH=8, ựổ thêm nước cất cho tới 250ml rồi ựem hấp khử trùng.
+ Dung dịch SDS
Hoà tan 25g Sodium dodecyl sunface (SDS) (MW=228.4) trong 200ml nước cất vô trùng, ựun nóng khoảng 60oC nhằm hoà tan nhanh SDS, sau ựó chỉnh bằng nước cất vô trùng cho tới 250ml.
b)Các mồi sử dụng ựể hiện ra gen kháng bạc lá Xa4, xa5, Xa7
Bảng 3.4. Các mồi sử dụng ựể hiện ra gen kháng bạc lá Xa4, xa5, Xa7
Tên mồi Trình Tự mồi NST Gen liên kết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khoảng
cách (c.M) Nguồn
Npb181F 5Ơ-ATC GAT CGA TCT TCA CGA GG-3Ơ
11 Xa4 1.7
Yoshida et al.1992 Npb78R 5Ơ-GTG CTA TAA AAG
GCA TTC GGG-3Ơ RG207F 5Ơ-ATT GTT ACG TTT GGT GGGGG-3Ơ 5 xa5 0-1 Mc Couch et al.1991 RG207R 5Ơ-GCC ATG GCG ATC
GTC AGTCG-3Ơ
P3 F 5Ơ-CAG CAA TTC ACT GGA GTA GTG GTT-3Ơ
5 Xa7 2.5 Taura et
al.2003 P3 R 5Ơ-CAT CAC GGT CAC
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
c) Tiến hành phản ứng PCR bằng máy chu kỳ nhiệt
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng PCR cho một gen Xa4, xa5, xa7
STT Thành phần Nồng ựộ dung dịch Thể tắch 1 Nước cất vô trùng 13.24 2 PCR bufer 10x 2.0 3 dNTPS 2mM 0.16 4 Primer-F 200mg/ộl 1.0 5 Primer-R 200mg/ộl 1.0
6 Taq polymerase 500unit/ộl 0.1
7 MgCl2 1.5
Thể tắch cocktai 19.0
9 DNA 300-400ộG 1.0
Tổng thể tắch phản ứng 20
- Quy trình phản ứng PCR: Sau khi cho ựủ các thành phần phản ứng và DNA cần nhân vào ống PCR (các ống này ựược ựánh số thứ tự theo các giống lúa) sau ựó cho vào trong máy nhân gen ựể chạy phản ứng PCR. đặt chu kỳ nhiệt cho phản ứng.
+ Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7 như sau:
Bảng 3.6. Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7
Bước Nhiệt ựộ (0C) Thời gian
1 94 4 phút 2 94 1 phút 3 56 1 phút 4 72 2 phút 5 Lặp lại 34 lần từ bước 2 6 72 8 phút 7 4 8 Kết thúc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36 + Chu kì nhiệt cho gen xa5 như sau:
Bảng 3.7. Chu kì nhiệt cho gen xa5
Bước Nhiệt ựộ (0C) Thời gian
1 94 4 phút 2 94 1 phút 3 60 1 phút 4 72 1 phút 50 giây 5 Lặp lại 34 lần từ bước 2 6 72 7 phút 7 4 8 Kết thúc d. Chạy ựiện di
Sau khi tiến hành phản ứng PCR, sản phẩm nhân gen sẽ ựược chạy ựiện di ựể xác ựịnh gen kháng bạc lá lúa.
- Chuẩn bị gel chạy ựiện di: Cân 1,5 g agarose cho vào 50 ml dung dịch TAE và 50 ml nước cất ựem ựun sôi trong lò vi sóng, sau ựó lấy ựem ra khuấy từ từ cho tới khi dung dịch trong suốt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- đổ dung dịch agarose 1,5% vào khuôn gel cho tới khi ựông ựặc thì rút lược ra. đổ ựầy dung dịch TAE vào bể ựiện di sao cho ngập giếng.
- Trải một màng parafin, nhỏ 1ộl loading dye, trộn với 8ộl dung dịch PCR, sau ựó trộn ựều và nhỏ hỗn hợp vào giếng. Nhỏ theo thứ tự DNA của các giống ựã ựược ựánh số.
- Cắm nguồn ựiện một chiều (75V) chạy ựiện di trong khoảng 25 ựến 50 phút. DNA mang ựiện tắch âm sẽ chạy về cực dương của nguồn ựiện.
- Sau khi chạy ựiện di xong, nhuộm bản ựiện di bằng ethilium bromide nồng ựộ 10mg/ml trong 10 phút.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37 xem có gen kháng hay không.
Khi chạy ựiện di ngoài DNA của các giống, cần chạy ựiện di của cả IR24 và các dòng chỉ thị chứa gen kháng: IRBB4, IRBB5, IRBB7 ựể so sánh, ựánh giá giống ựó có chứa gen kháng hay không.