2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật
- Nghiên cứu về đặc điểm hình thái được quan sát bằng mắt thường, kính lúp soi nổi và mô tả theo phương pháp mô tả phân tích.
- Nghiên cứu về cấu tạo giải phẫu: sử dụng phương pháp nhuộm kép, quan sát trên kính hiển vi, mô tả theo phương pháp mô tả phân tích.
2.3.2. Nghiên cứu hàm lượng Borneol
Định lượng Mai hoa băng phiến trong Đại bi
Nguyên liệu được cắt nhỏ, cất tinh dầu bằng bộ định lượng tinh dầu nhẹ hơn nước, theo phương pháp cất kéo hơi nước, cho đến khi không còn tinh dầu trong dược liệu, Mai hoa băng phiến thu được dưới dạng rắn, đem cân để xác dịnh hàm lượng MHBP.
Song song tiến hành xác định hàm ẩm dược liệu theo phương pháp nhiệt độ, sử dụng máy đo hàm ẩm ở nhiệt độ là 100°C.
Hàm lượng Mai hoa băng phiến trong dược liệu khô tuyệt đối được xác định theo công thức:
Trong đó: a: khối lượng Mai hoa băng phiến (g) H: hàm ẩm dược liệu (%)
X: hàm lượng Mai hoa băng phiến (%)
Xác định hàm lượng Borneol trong dược liệu
Phân tích thành phần tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ (GC-MS) tại Viện Pháp y Quân đội. Điều kiện phân tích: Tốc độ dòng khí He 0,9 ml/phút, nhiệt độ buồng bơm mẫu 265°C, nhiệt độ detector 280°C, nhiệt độ MS source 230°C, nhiệt độ quard 150°C. Chương trình nhiệt độ của cột là: 70°C giữ 2 phút, tăng 30°C/phút đến 190°C, tăng tiếp 5°C/phút đến 270°C, giữ 15 phút. Bơm mẫu theo chế độ chia dòng 10:1, thể tích bơm mẫu 1µl. Hàm lượng Borneol trong dược liệu được tính theo công thức: Y= X.A
Trong đó:
Y: Hàm lượng Borneol trong dược liệu (%) X: Hàm lượng MHBP trong dược liệu (%) A: Tỷ lệ Borneol trong MHBP (%)
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả thực nghiệm
3.1.1. Đặc điểm thực vật và hàm lượngBorneol của các mẫu Đại bi
Đặc điểm hình thái
Các mẫu Đại bi thu được có đặc điểm hình thái tương đối giống nhau, các đặc điểm chung của các mẫu được mô tả như sau:
Cây bụi, cao 1-3m, màu xanh ở phần thân non, nâu xanh ở phần thân già. Thân tiết diện gần tròn, có khía dọc, đường kính 5-10 mm. Toàn cây có mùi thơm và có lông tơ mịn. Phân cành dạng ngù ở phía ngọn. Lá đơn, mọc cách. Phiến lá thuôn dài, kích thước 8-27 x 2,0-7,6 cm, mặt trên màu xanh đậm, ít lông hơn mặt dưới. Mặt dưới lá phủ nhiều lông mượt. Mép lá xẻ răng cưa. Gân lá hình lông chim nổi rõ ở mặt dưới, có 9-17 cặp gân.Cuống lá hình trụ, màu xanh, hơi phẳng ở mặt trên; mang 1-4 cặp phụ bộ kích thước nhỏ dần về phía đáy cuống (Hình 3.1). Cụm hoa đầu thường hợp thành chùm xim ở ngọn cành hay nách lá, kích thước rất thay đổi. Đầu hình trứng khi là nụ, khi hoa nở đầu có hình chuông hơi thắt ở giữa, kích thước khoảng 0,6–1,0 x 0,3–0,5 cm; cuống ngắn 0,1–0,6 cm, có 1-3 vảy ngắn. Tổng bao lá bắc 5–7 hàng lá bắc xếp kết lợp, hình bầu dục đến dải hẹp, vòng trong dài hơn vòng ngoài, kích thước 1–5 x 0,2–0,5 mm, màu xanh, đỉnh màu nâu hoặc nâu tím, rìa mỏng, mặt ngoài có nhiều lông. Đế cụm hoa hơi lồi, đường kính khoảng 2 – 4 mm, lỗ tổ ong. Đầu mang hoa hình ống, có hai loại hoa: hoa cái rất nhiều xếp 3-4 vòng ở ngoài, hoa lưỡng tính 18-25 hoa ở trong (Hình 3.2). Hoa cái màu vàng nhạt, những hoa ở ngoài cùng thường có hình trụ cong; đài biến đổi thành túm lông dài màu trắng; tràng hoa màu vàng nhạt, dính thành một ống hẹp, dài 4- 6mm, trên chia 2-3 thùy tam giác nhỏ, có lông tiết tinh dầu thơm; bầu dưới 1
ô, màu trắng trong mờ, hình trụ hẹp ở gốc; vòi nhụy vàng nhạt, dạng sợi dài khoảng 5–7 mm, tận cùng là 2 nhánh đầu nhụy màu vàng đậm hình máng hẹp dài 1–2 mm. Hoa lưỡng tính lớn hơn hoa cái, màu vàng nhạt; tràng hoa hình ống dài, loe dần, trên chia 5 thùy hình tam giác có màu vàng đậm; nhị 5, chỉ nhị rời, dạng sợi, dài khoảng 1–2 mm, màu vàng nhạt, bao phấn dính nhau thành ống dài khoảng 2–3 mm, bao lấy vòi nhụy, màu vàng đậm; vòi nhụy dạng sợi dài khoảng 5–7 mm, đầu nhụy 2, dài khoảng 1–2 mm, màu vàng đậm, dạng máng cạn, thuôn hẹp. Quả bế màu vàng nâu, hình trụ dài khoảng 0,5–1mm, mặt ngoài vỏ có lông ngắn màu trắng và có 4-6 gờ dọc, trên mang túm lông mào dài, màu trắng của đài tồn tại, gốc có vòng gờ chỗ gắn với đế hoa; 1 hạt (Hình 3.3).
1: Cành, 2: Chiều dài lá, 3: Chiều rộng lá
1: Cụm hoa; 2: Lá bắc; 3: Hoa cái và hoa lưỡng tính; 4: Đế cụm hoa cắt dọc
1: Đầu ống tràng hoa lưỡng tính, 2: Chỉ nhị và bao phấn, 3: Bao phấn cắt dọc, 4: Quả mang mào lông
Hình thái các mẫu Đại bi có một số đặc điểm khác nhau (Bảng 3.1):
Bảng 3.1: Các đặc điểm hình thái khác nhau giữa các mẫu
Đặc điểm Mô tả A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
Màu sắc thân gần điểm phân cành (Hình 3.4) Xanh x x x x x x x Hơi tím x Mật độ lông che chở (Hình 3.6) Ít x x x x Nhiều x x x x
Hình thái lá qua các giai đoạn (Hình 3.5) Thay đổi x x Không đổi x x x x x x
Màu sắc đỉnh thùy của hoa lưỡng tính (Hình 3.8) Vàng x x x x x x x Hơi tím x Đặc điểm ngọn lá bắc (Hình 3.7) Màu nâu x x x x x Màu nâu tím x x x
Tỷ lệ trung bình chiều dài lá/ chiều rộng lá
1: Thân màu xanh, 2: Thân màu tím Hình 3.5: Sự thay đổi hình Hình 3.4: Sự khác nhau về màu sắc thái lá ở các giai đoạn thân gần điểm phân cành
1: Lông che chở ít và ngắn, 2: Lông che chở nhiều và dài
Hình 3.6: So sánh mật độ lông che chở
1 2
Màu nâu tím Màu nâu
Hình 3.7: Đặc điểm ngọn lá bắc
Màu tím hồng Màu vàng
Đặc điểm vi phẫu
Đặc điểm vi phẫu của các mẫu không có sự khác biệt, được mô tả như sau: - Vi phẫu thân: Hình 3.9. 2 1 6 7 4 5 5 10 8 8 8 9 9 11 10 3 3
1: Biểu bì; 2: Lông che chở; 3: Lông tiết đa bào; 4: Mô dày; 5: Tế bào tiết tinh dầu; 6: Mô cứng; 7: Libe; 8: Tầng phát sinh libe - gỗ; 9: Gỗ; 10: Mô mềm ruột.
Hình 3.9: Đặc điểm vi phẫu thân
Mặt cắt của thân có hình gần tròn, từ ngoài vào trong bao gồm: (1) Lớp biểu bì: là một lớp tế bào nhỏ xếp ngoài cùng, hình chữ nhật
hoặc hình tròn, không đều. Trên lớp biểu bì có nhiều lông che chở đa bào và lông tiết đa bào. (2) Lông che chở đa bào có cấu tạo gồm một dãy 3 – 5 tế bào dài ở phía trên và nhiều tế bào nhỏ, ngắn xếp trên 1 – 3 hàng ở gần gốc. (3) Lông tiết đa bào có chân dài hoặc ngắn, đầu hình trứng thuôn cấu tạo bởi nhiều hàng tế bào có lớp cutin phù thành mũ chụ. (4) Mô dày là 4 – 8 lớp tế bào tròn hoặc đa giác gần tròn, bắt màu hồng đậm, kích thước không đều nhau, lớn hơn hoặc bằng tế bào biểu bì. (5) Tế bào tiết tinh dầu rải rác trong
mô dày, mô mềm vỏ, mô mềm ruột. Các bó libe-gỗ xếp theo một vòng tròn. (6) Mô cứng xếp thành từng cụm không đều ở trên libe. (7) Libe nhiều tế bào hình đa giác, kích thước nhỏ, bắt màu hồng. (8) Tầng phát sinh libe-gỗ ở giữa libe và gỗ, gồm nhiều lớp tế bào nhỏ, có vách tế bào mỏng. (9) Gỗ có mạch gỗ hình tròn, mô mềm gỗ gồm nhiều tế bào hình đa giác vách cellulose. (10) Mô mềm ruột chiếm một vùng rộng, gồm nhiều tế bào hình tròn hoặc gần tròn, kích thước không đều.
- Vi phẫu gân lá: Hình 3.10. 6 6 5 5 2 4 7 1 3 8
1: Biểu bì; 2: Lông tiết đa bào; 3: Lông che chở; 4: Mô dày; 5: Libe; 6: Gỗ; 7: Tế bào tiết; 8: Mô mềm
Hình 3.10: Đặc điểm vi phẫu gân lá
Gân lá mặt trên lồi cao hơi bằng ở đỉnh, mặt dưới phình tròn thắt ở hai bên phiến lá, đôi khi có gờ lồi phụ. (1) Tế bào biểu bì hình bầu dục hay chữ nhật kích thước không đều, có rất nhiều lông che chở và lông tiết đa bào. (2) Lông tiết bào và (3) lông che chở có cấu trúc giống ở thân. (4) Mô dày: 5 – 7
lớp tế bào dưới biểu bì trên và 1-6 lớp tế bào trên biểu bì dưới, tế bào kích thước không đều. (5) Libe: tế bào kích thước nhỏ, hình đa giác, xếp lôn xộn, bắt màu hồng. (6) Mạch gỗ hình tròn, xếp thành 3-8 dãy xen kẽ với 1-2 dãy tế bào mô mềm gỗ vách cellulose. (7) Tế bào tiết rải rác trong mô mềm. (8) Mô mềm: gồm nhiều lớp tế bào hình tròn, thành mỏng. - Vi phẫu phiến lá: Hình 3.11. 1 1 3 3 5 5 6 2 4
1: Biểu bì trên; 2: Biểu bì dưới; 3 Mô dậu; 4: Lông che chở; 5: Lông tiết; 6: Tế bào tiết
Hình 3.11: Đặc điểm vi phẫu phiến lá
(1) Biểu bì trên tế bào hình bầu dục, kích thước không đều. (2) Biểu bì dưới tế bào có kích thước nhỏ hơn biểu bì trên nhiều lần. Cả 2 lớp biểu bì đều có nhiều lông che chở và lông tiết đa bào có cấu tạo giồng như ở thân. (3) Mô giậu ăn sâu vào phần gân giữa, gồm 1 lớp tế bào. Tế bào mô giậu hình chữ nhật có chiều dài gấp 3 lần chiều rộng.Tế bào tiết nằm rải rác trên phiến lá.
Hàm lượng Borneol
Các mẫu Mai hoa băng phiến của 8 mẫu Đại bi thu hái vào tháng 11 năm 2012 được phân tích cho thấy: tất cả các mẫu đều chứa Borneol và Camphor. Pic sắc kí của các mẫu MHBP được trình bày ở Phụ lục 3.
Tỷ lệ Borneol trong các mẫu Mai hoa băng phiến thay đổi từ 95,6% - 99,7% (Bảng 3.2).
Bảng 3.2: Tỷ lệ Borneol trong Mai hoa băng phiến (tháng 11)
Mẫu Tỷ lệ Borneol (%) A1 99,5 A2 99,3 A3 95,6 A4 99,2 A5 98,3 A6 98,3 A7 99,7 A8 99,5
Hàm lượng Borneol trong dược liệu khô tuyệt đối của các mẫu thay đổi từ 0,63%-0,84% (Bảng 3.3).
Bảng 3.3: Hàm lượng Borneol trong các mẫu (tháng 11)
Mẫu Hàm lượng Borneol (%)
A1 0,84 A2 0,67 A3 0,73 A4 0,64 A5 0,73 A6 0,68 A7 0,68 A8 0,63
Hàm lượng Borneol trong dược liệu khô tuyệt đối của các mẫu có sự chênh lệch không nhiều (Hình 3.12).
Hình 3.12: Biểu đồ hàm lượng Borneol trong dược liệu khô tuyệt đối của các mẫu (tháng 11)
3.1.2. Sự thay đổi hàm lượng Mai hoa băng phiến theo thời gian
Kết quả định lượng hàm lượng Mai hoa băng phiến trong dược liệu khô tuyệt đối của các mẫu Đại bi vào các tháng 9, 10, 11, 12 năm 2012 và các tháng 1, 2, 3, 4 năm 2013 như sau (Bảng 3.4):
,000% ,100% ,200% ,300% ,400% ,500% ,600% ,700% ,800% ,900% A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 %Borneol %Borneol Mẫu
Bảng 3.4: Hàm lượng Mai hoa băng phiến trong các mẫu nghiên cứu Mẫu Năm 2012 Năm 2013 Tháng 9 (%) Tháng 10 (%) Tháng 11 (%) Tháng 12 (%) Tháng 1 (%) Tháng 2 (%) Tháng 3 (%) Tháng 4 (%) A1 1,54 1,51 0,84 0,78 0,52 0,44 0,42 0,61 A2 1,40 1,41 0,67 0,39 0,29 0,26 0,23 0,36 A3 1,37 1,36 0,76 0,74 0,26 0,24 0,23 0,33 A4 1,31 0,72 0,65 0,39 0,31 0,25 0,22 0,39 A5 1,15 1,02 0,74 0,45 0,29 0,28 0,23 0,29 A6 1,12 1,00 0,69 0,68 0,32 0,25 0,24 0,34 A7 1,08 0,94 0,68 0,38 0,28 0,24 0,22 0,38 A8 1,00 0,89 0,63 0,49 0,30 0,28 0,26 0,35
Hàm lượng Mai hoa băng phiến trong dược liệu khô tuyệt đối của các mẫu Đại bi nằm trong khoảng 0,22% - 1,54%. Các mẫu Đại bi có hàm lượng MHBP cao nhất vào tháng 9/2012, giảm dần và thấp nhất vào tháng 3/2013 là thời điểm cây ra hoa, sau đó lại tăng lên vào tháng 4/2013 là thời điểm cây đậu quả (Hình 3.13).
Hình 3.13: Biểu đồ sự thay đổi hàm lượng Mai hoa băng phiến 8 mẫu Đại bi theo thời gian
3.2. Bàn luận
Theo một nghiên cứu về tính đa dạng sinh học cây Đại bi ở miền Bắc
Việt Nam, các cây thuộc loài Blumea balsamifera (L.) DC. khá đa dạng. Với
cùng một thời điểm thu hái, các mẫu Đại bi thu hái ở các địa điểm khác nhau có sự khác biệt lớn về hàm lượng tinh dầu (0,32%-2,19%) và hàm lượng Borneol trong tinh dầu (3,34%-82,23%) [10]. Để cố định các biến về điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng và chăm sóc, các mẫu Đại bi được lấy giống từ các tỉnh khác nhau: Hà Giang, Hà Nội, Điện Biên, Thái Nguyên; trồng tại một địa điểm (Yên Ninh – Phú Lương – Thái Nguyên).
,000% ,200% ,400% ,600% ,800% 1,000% 1,200% 1,400% 1,600% 1,800% T9 T10 T11 T12 T1 T2 T3 T4 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 %Borneol Thời gian
Kết quả nghiên cứu về hình thái cho thấy các mẫu Đại bi có sự khác nhau về màu sắc thân, màu sắc ở đỉnh thùy hoa lưỡng tính, đặc điểm ngọn lá bắc, mật độ lông che chở. Kết quả định lượng hàm lượng và thành phần Mai hoa băng phiến của các mẫu Đại bi tại cùng một thời điểm thu hái (tháng 11 năm 2012) không có sự khác biệt rõ rệt: Hàm lượng Mai hoa băng phiến từ 0,63%-0,84%; hàm lượng Borneol trong MHBP từ 95,6%-99,7%; hàm lượng Borneol trong dược liệu khô tuyệt đối của các mẫu từ 0,63%-0,84%. Như vậy, sau khi cố định các biến thuộc điều kiện sinh thái thì sự sai khác về hàm lượng MHBP và Borneol giữa các mẫu giảm đi đáng kể, các mẫu có xu hướng giống nhau về hàm lượng và thành phần MHBP. Kết quả này bước đầu chỉ ra rằng điều kiện sinh thái có ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng và thành phần tinh dầu Đại bi. Tuy nhiên, tại thời điểm hàm lượng MHBP lớn nhất (tháng 9), hàm lượng MHBP trong các mẫu Đại bi có sự khác biệt rõ rệt hơn (1,00%-1,54%). Điều này cho thấy yếu tố nguồn gen có ảnh hưởng đến hàm lượng MHBP của các mẫu Đại bi.
Kết quả định lượng hàm lượng Mai hoa băng phiến cho thấy hàm lượng MHBP của các mẫu Đại bi cao nhất vào tháng 9 năm 2012 (1,00% - 1,54%), giảm dần và thấp nhất vào tháng 3 năm 2013 (0,22 – 0,42%), sau đó lại tăng lên vào tháng 4 năm 2013 (0,29%-0,61%). Thời điểm hàm lượng MHBP thấp nhất là mùa xuân, lúc cây ra hoa và thời điểm hàm lượng MHBP cao nhất là mùa thu, điều này phù hợp với kinh nghiệm thu hái Đại bi của nhân dân ta và một nghiên cứu trước đó tại Việt Nam [8]. Tuy nhiên, cần phải tiếp tục định lượng hàm lượng Mai hoa băng phiến vào các tháng 5, 6, 7, 8 của năm 2013 và thành phần MHBP của tất cả các tháng trong năm để tìm ra thời điểm thu hái Đại bi tối ưu nhất.
Kết quả phân tích thành phần tinh dầu cho thấy hàm lượng Borneol trong Mai hoa băng phiến của các mẫu từ 95,6% - 99,7% là rất cao, trong khi
đó hàm lượng của Borneol trong tinh dầu của một số cây được sử dụng để cất
trong công nghiệp như Dipterocarpus turbinatus C. F. Gaertn.
(Dipterocarpaceae) 30%-65% [40], Amomum villosum var. xanthioides (Wall.
ex Baker) T.L.Wu & S.J.Chen (Zingiberaceae) 19% [8], Micromeria cristata
(Hampe) Griseb.subsp. phrygia P. H. Davis (Lamiaceae) 27% - 39% [40].
Chứng tỏ đây là nguồn nguyên liệu phù hợp dùng để khai thác Borneol thiên nhiên. Hàm lượng Borneol trong Mai hoa băng phiến của tất cả các mẫu nghiên cứu lớn hơn nhiều so với hàm lượng Borneol trong tinh dầu của các mẫu Đại bi trong các nghiên cứu trước đó tại Việt Nam (3,34% - 82,23%) [14], [10], [7]. Do đó cần tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm sinh thái có liên quan đến hàm lượng Borneol để tạo được vùng trồng nguyên liệu khai thác Borneol từ cây Đại bi.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:
Nghiên cứu mô tả chi tiết được đặc điểm hình thái, vi phẫu của 8 mẫu Đại bi có nguồn gốc khác nhau từ Hà Nội, Hà Giang, Thái Nguyên, Điện Biên được trồng tại cùng một địa điểm (Yên Ninh - Phú Lương - Thái Nguyên) có sự khác nhau về hình thái: màu sắc thân, màu sắc đỉnh tràng hoa lưỡng tính, màu sắc đỉnh lá bắc, mật độ lông che chở,… Với cùng một thời điểm thu hái là tháng 11/2012, 8 mẫu Đại bi không có sự khác biệt rõ rệt về hàm lượng Borneol trong dược liệu khô tuyệt đối (0,63%-0,84%). Hàm lượng Borneol