chiết nước
Để đánh giá ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat của dịch chiết nước của hai loài nghiên cứu, thí nghiệm được bố trí song song giữa hai loài nghiên cứu ở các độ pha loãng 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 với chứng dương là natri citrat 15mM (nồng độ trong mỗi giếng) pha trong môi trường nước. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 và hình ảnh tinh thể calci oxalat được trình bày ở hình 3.10
Bảng 3.1.Ảnh hưởng của natri citrat và dịch chiết nước ở các độ pha loãng 1/16, 1/8, 1/4, 1/2, 1/1 trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitrocủa hai loài D.
heterophyllum (Willd.) DC. và D. triflorum (L.) DC
D. heterophyllum (Willd.) DC. D. triflorum (L.) DC.
ODTB ± SD ΔOD hoặc %UC ODTB ± SD ΔOD hoặc %UC Trắng tinh thể 0,208 ± 0,02 0,208±0,02 Natri citrat 15mM 0,028 ± 0,006 (*) 86,37% 0,028 ± 0,006 (*) 86,37% 1/16 0,201 ± 0,007 3,51% 0,195 ± 0,02 (*)(**) 6,25% 1/8 0,220 ± 0,01 ΔOD=0,012 0,249 ± 0,02 (*)(**) ΔOD=0,031 1/4 0,284 ± 0,008 (*)(**) ΔOD=0,076 0,280 ± 0,01 (*) (**) ΔOD=0,072 1/2 0,322 ± 0,008 (*)(**) ΔOD=0,114 0,348 ± 0,01 (*)(**) ΔOD=0,14 1/1 0,381 ± 0,01 (*)(**) ΔOD=0,163 0,412 ± 0,02 (*) (**) ΔOD=0,204
(*), p < 0,05 khi so sánh với lô trắng tinh thể; (**), p < 0,05 khi so sánh với chứng dương natri citrat
33
Hình 3.10. Hình ảnh tinh thể calci oxalat tạo thành trong điều kiện không có chất thử (trắng tinh thể), có natri citrat và trong điều kiện có mặt dịch chiết nước hai loài D. heterophyllum (Willd.) DC. (Dh)
và D. triflorum (L.) DC. (Dt) ở các độ pha loãng
1/16 1/8 1/4 1/2 1/1
1/16 1/8 1/4 1/2 1/1
Dh
Trắng tinh thể Natri citrat
Nhận xét:
* Natri citrat (chứng dương):
- Trên OD620nm: natri citrat thể hiện tác dụng ức chế mạnh sự tạo thành tinh thể calci oxalat với tỷ lệ ức chế đạt 86, 37% (p<0,05 so với mẫu trắng tinh thể).
- Trên hình ảnh: sự có mặt của natri citrat làm tinh thể calci oxalat tạo thành có số lượng ít hơn, kích thước nhỏ hơn, tinh thể có xu hướng chuyển dạng từ COM sang COD.
* Loài D. heterophyllum (Willd.) DC.
- Trên OD620nm: dịch chiết nước loài D. heterophyllum (Willd.) DC. thể hiện tác dụng ức chế tạo thành tinh thể ở độ pha loãng 1/16, tuy nhiên tác dụng này yếu (3,51%). Ở các độ pha loãng còn lại đều làm tăng số lượng tinh thể tạo thành so với mẫu trắng tinh thể, thể hiện ở giá trị OD620nm đo được tăng lên so với lô trắng tinh thể. Ảnh hưởng này tăng dần theo nồng độ, nồng độ tương ứng với độ pha loãng 1/1 thể hiện ảnh hưởng mạnh nhất.
- Trên hình ảnh tinh thể: dịch chiết nước làm giảm kích thước tinh thể. Ở độ pha loãng 1/16, lượng tinh thể dạng COM chiếm ưu thế so với dạng COD. Khi nồng độ tăng lên, tương ứng với các độ pha loãng 1/8, 1/4, dạng COM giảm dần và bé dần, dạng COD tăng dần và chiếm ưu thế. Ở nồng độ cao trong khoảng khảo sát tương ứng với các độ pha loãng 1/2 và 1/1, tinh thể tạo thành nhiều, kích thước nhỏ, hầu hết ở dạng COD.
* Loài D. triflorum (L.) DC.
- Trên OD620nm: Tương tự dịch chiết nước loài D. heterophyllum (Willd.) DC., ở độ pha loãng 1/16, dịch chiết nước D. triflorum (L.) DC. cũng thể hiện tác dụng ức chế tạo thành tinh thể (6,25%). Các độ pha loãng còn lại đều làm tăng số lượng tinh thể tạo thành so với mẫu trắng tinh thể với xu hướng tăng dần theo chiều tăng nồng độ.
- Trên hình ảnh tinh thể: kích thước tinh thể calci oxalat tạo thành giảm dần khi nồng độ dịch chiết tăng dần (tương ứng với các độ pha loãng 1/16 - 1/2), đồng thời tinh thể tạo thành có dạng COD tăng dần. Tuy nhiên, tinh thể COD tạo thành
có số lượng nhiều hơn so với loài D. heterophyllum(Willd.) DC. khi so sánh ở cùng độ pha loãng.
3.2.2. Ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat của natri citrat và dịch chiết ethanol 70%
Ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat của dịch chiết ethanol 70% của hai loài nghiên cứu được tiến hành tương tự dịch chiết nước ở các độ pha loãng 1/16, 1/8, 1/4, 1/2, 1/1 với chứng dương là natri citrat 15mM (nồng độ trong mỗi giếng) pha trong nước. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 và hình ảnh tinh thể calci oxalat được trình bày ở hình 3.11.
Bảng 3.2.Ảnh hưởng của natri citrat và dịch chiết ethanol 70% trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro của hai loài nghiên cứu
D. heterophyllum (Willd.) DC. D. triflorum (L.) DC.
ODTB ± SD ΔOD hoặc %UC ODTB ± SD ΔOD hoặc %UC Trắng tinh thể 0,095 ± 0,02 0,095 ± 0,02 Natri citrat 15mM 0,012 ± 0,02 87,36% 0,012 ± 0,02 87,36% 1/16 0,105 ± 0,01 ΔOD=0,01 0,107 ± 0,02 ΔOD=0,012 1/8 0,098 ± 0,006 ΔOD=0,003 0,097 ± 0,007 ΔOD=0,002 1/4 0,092 ± 0,01 (*) 3,16% 0,087 ± 0,02 (*) 2,94% 1/2 0,071 ± 0,02 (*)(**) 24,74% 0,079 ± 0,02 (*)(**) 16,84% 1/1 0,052 ± 0,02 (*) (**) 45% 0,052 ± 0,02 (*) (**) 45%
(*), p < 0,05 khi so sánh với lô trắng tinh thể; (**), p < 0,05 khi so sánh với chứng dương natri citrat
36
Hình 3.11. Hình ảnh tinh thể calci oxalat tạo thành trong điều kiện không có chất thử (trắng tinh thể), có natri citrat và trong điều kiện có mặt dịch chiết ethanol 70% hai loài D. heterophyllum (Willd.) DC. (Dh)
và D. triflorum (L.) DC. (Dt) ở các độ pha loãng
1/16 1/8 1/4 1/2 1/1
1/16 1/8 1/4 1/2 1/1
Trắng tinh thể Natri citrat
Dh
Nhận xét:
* Loài D. heterophyllum (Willd.) DC.
-Trên OD620nm: Ở hai độ pha loãng 1/16 và 1/8, dịch chiết ethanol 70% của loài D. heterophyllum (Willd.) DC. không thể hiện tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat mà ngược lại còn làm tăng số lượng tinh thể với OD620nm so với lô trắng tinh thể. Khi nồng độ dung dịch thử tăng lên tương ứng với các độ pha loãng 1/4 - 1/1, tỷ lệ ức chế tạo thành tinh thể calci oxalat cũng tăng lên, đạt cao nhất ở độ pha loãng 1/1 (45%).
- Trên hình ảnh tinh thể: Ở các độ pha loãng 1/16, 1/8, 1/4, tinh thể calci oxalat tạo thành có kích thước lớn hơn so với mẫu trắng tinh thể, tuy nhiên số lượng tinh thể tạo thành giảm dần và lượng tinh thể COD cũng chiếm ưu thế so với dạng COM. Đến độ pha loãng 1/2 và 1/1 thì kích thước tinh thể tạo thành nhỏ hơn so với mẫu trắng tinh thể và tinh thể chủ yếu ở dạng COD. Ảnh hưởng này mạnh nhất ở độ pha loãng 1/1.
* Loài D. triflorum (L.) DC.
Xu hướng ảnh hưởng của dịch chiết ethanol 70% loài D. triflorum (L.) DC. lên sự hình thành tinh thể calci oxalat hoàn toàn tương tự xu hướng của loài D. heterophyllum(Willd.) DC. trên cả OD620nmvà trên hình ảnh tinh thể. Tỷ lệ ức chế hình thành tinh thể calci oxalat của dịch chiết ethanol 70% loài D. triflorum (L.) DC. cũng đạt giá trị cao nhất 45% ở độ pha loãng 1/1. Trên hình ảnh tinh thể, sự có mặt của dịch chiết ethanol 70% loài D. triflorum (L.) DC. làm tinh thể tạo thành có kích thước lớn hơn và số lượng nhiều hơn so với dịch chiết ethanol 70% loài D. heterophyllum(Willd.) DC. khi so sánh ở cùng độ pha loãng.
3.2.3. Ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat của natri citrat và cắn các phân đoạn của dịch chiết ethanol 70%.
3.2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của ethanol lên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro
Ảnh hưởng của ethanol ở các nồng độ 80%, 50%, 20%, 10%, 5% lên sự hình thành tinh thể calci oxalat được đánh giá song song với mẫu trắng tạo tinh thể trong
nước. Kết quả đo giá trị OD620nmvà hình ảnh tinh thể được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.12.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của ethanol lên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro
Nồng độ ethanol (%) ODTB ± SD ΔOD 0 5 10 20 50 80 0,18 ± 0,02 0,17 ± 0,02 0,18 ± 0,01 0,21 ± 0,01 0,34 ± 0,01(*) 0,63 ± 0,02(*) - -0,01 0,00 0,03 0,16 0,45
(*), p < 0,05 khi so sánh với lô trắng tinh thể
0% 5% 10%
20% 50% 80%
Hình 3.12. Hình ảnh tinh thể calci oxalat tạo thành trong dung môi ethanol ở các nồng độ khác nhau
Nhận xét:
Sự có mặt của ethanol có ảnh hưởng rõ rệt đến số lượng tinh thể và kích thước tinh thể calci oxalat tạo thành ở các nồng độ cao (50% và 80%). Ở các nồng độ thấp (5%, 10%, 20%), sự có mặt của ethanol hầu như không ảnh hưởng đến số lượng, kích thước tinh thể và tỷ lệ dạng COD/COM tạo thành. Do đó, dung dịch ethanol 20% được chúng tôi lựa chọn làm dung môi để hòa tan cắn các phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% của hai loài D. heterophyllum (Willd.) DC. và D. triflorum (L.) DC.
3.2.3.2. Ảnh hưởng của cắn các phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% của hai loài D. heterophyllum (Willd.) DC. và D. triflorum (L.) DC.
Cắn các phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% của hai loài nghiên cứu được chuẩn bị theo quy trình ở mục 2.3.3.1.
Hàm lượng cắn các phân đoạn thu được được tính theo công thức:
F(%) = ×100
Trong đó:
F là hàm lượng cắn (%) a là khối lượng cắn (gam)
M là khối lượng dược liệu (gam) h là hàm ẩm của dược liệu
Bảng 3.4. Hàm lượng cắn các phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% hai loài D.heterophyllum (Willd.) DC. và D. triflorum (L.) DC.
Loài Cắn phân đoạn Khối lượng (g) Hàm lượng (%) D. heterophyllum (Willd.) DC. n- hexan 0,2119 0,45 CHCl3 0,2221 0,47 EtOAc 0,6275 1,3 Cắn nước 6,2565 13,61 D. triflorum (L.) DC. n- hexan 0,2793 0,56 CHCl3 0,1706 0,34 EtOAc 0,3511 0,7 Cắn nước 13,3984 26,8
Để đánh giá ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat của cắn các phân đoạn của hai loài nghiên cứu, thí nghiệm được bố trí song song giữa hai loài nghiên cứu ở các nồng độ cuối cùng trong giếng tương ứng với các mẫu thử là 1µg/ml, 10µg/ml, 100µg/ml với chứng dương là natri citrat 15mM pha trong dung dịch ethanol 20%. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và hình ảnh tinh thể calci oxalat được trình bày ở hình 3.13, hình 3.14.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của natri citrat và cắn các phân đoạn dịch chiết ethanol 70% của hai loài nghiên cứu trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro
D. heterophyllum (Willd.) DC. D. triflorum (L.) DC. ODTB ± SD ΔOD hoặc %UC ODTB ± SD ΔOD hoặc %UC Trắng tinh thể 0,15 ± 0,03 0,15 ± 0,03 CD 15mM 0,02 ± 0,01 88,19% 0,02 ± 0,01 88,19% n-hexan Trắng tinh thể 0,121 ± 0,04 0,079 ± 0,01 1 µg/ml 0.096 ± 0,02 20,48% 0,101 ± 0,02 ΔOD=0,022 10 µg/ml 0,147 ± 0,02 (*) ΔOD=0,026 0,125 ± 0,02 (*) ΔOD=0,046 100 µg/ml 0,21 ± 0,01 (*) ΔOD=0,089 0,248 ± 0,01 (*) ΔOD=0,169 CHCl3 Trắng tinh thể 0,142 ± 0,01 0,128 ± 0,03 1 µg/ml 0,104 ± 0,02 (*) (**) 29,56% 0,088 ± 0,03 (*)(**) 31,39% 10 µg/ml 0,096 ± 0,01 (*) (**) 32,83% 0,097 ± 0,01 (*)(**) 24,52% 100 µg/ml 0,1 ± 0,02 (*) (**) 27,19% 0,135 ± 0,02 ΔOD=0,007 EtOAc Trắng tinh thể 0,143 ± 0,03 0,101 ± 0,02 1 µg/ml 0,111 ±0,01 (*)(**) 22,17% 0,092 ± 0,01 (**) 9,33% 10 µg/ml 0,120 ± 0,02 (*)(**) 16,96% 0,142 ± 0,02 (**) ΔOD=0,042 100 µg/ml 0,111 ± 0,02 (*)(**) 22,78% 0,110 ± 0,01 ΔOD=0,009 Phân đoạn nước còn lại Trắng tinh thể 0,123 ± 0,02 0,126 ± 0,01 1 µg/ml 0,119 ± 0,01 3,95% 0,114 ± 0,02 (*) (**) 8,93% 10 µg/ml 0,120 ± 0,03 2,43% 0,094 ± 0,02 (*) (**) 25,59% 100 µg/ml 0,122 ± 0,03 1,2% 0,106 ± 0,02 (*) 15,87%
(*), p < 0,05 khi so sánh với lô trắng tinh thể; (**), p < 0,05 khi so sánh với chứng dương natri citrat
Trắng tinh thể Natri citrat n-hexan: 1µg/ml 10µg/ml 100µg/ml CHCl3: 1µg/ml 10µg/ml 100µg/ml EtOAc: 1µg/ml 10µg/ml 100µg/ml Cắn nước: 1µg/ml 10µg/ml 100µg/ml
Hình 3.13. Hình ảnh tinh thể calci oxalat tạo thành trong điều kiện không có chất thử (trắng tinh thể), có natri citrat và trong điều kiện có mặt cắn các phân đoạncủa
Trắng tinh thể Natri citrat
n-hexan: 1µg/ml 10µg/ml 100µg/ml CHCl3: 1µg/ml 10µg/ml 100µg/ml EtOAc: 1µg/ml 10µg/ml 100µg/ml
Cắn nước: 1µg/ml 10µg/ml 100µg/ml
Hình 3.14. Hình ảnh tinh thể calci oxalat tạo thành trong điều kiện không có chất thử (trắng tinh thể), có natri citrat và trong điều kiện có mặt các cắn phân đoạn của
loài D. triflorum (L.) DC. ở các nồng độ
Nhận xét:
* Natri citrat (chứng dương)
Natri citrat (15mM) trong ethanol 20% thể hiện tác dụng ức chế mạnh sự tạo thành tinh thể calci oxalat với tỷ lệ ức chế đạt 88%, đồng thời số lượng tinh thể giảm đi rõ rệt và dạng COD chiếm ưu thế. Tác dụng này tương tự tác dụng natri citrat (15mM) trong nước.
* Loài D. heterophyllum (Willd.) DC.
- Trên OD620nm: Các phân đoạn đều thể hiện tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat nhưng rõ rệt nhất là phân đoạn chloroform là 32,83% (nồng độ 10µg/ml), ở phân đoạn ethyl acetat là 22,78% (nồng độ 100µg/ml). Đặc biệt tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat của hai phân đoạn này ít bị ảnh hưởng bởi nồng độ. Phân đoạn n-hexan có tỷ lệ ức chế đạt 20,48% (nồng độ 1µg/ml) nhưng tỷ lệ này giảm nhanh khi nồng độ tăng. Phân đoạn nước còn lại có tỷ lệ ức chế rất thấp.
- Trên hình ảnh tinh thể: Mật độ tinh thể, kích thước tinh thể ở hai phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn nước còn lại hầu như ít thay đổi so với mẫu tắng tinh thể. Với phân đoạn chloroform, nồng độ thấp nhất 1µg/ml làm giảm số lượng tinh thể calci oxalat, hai nồng độ cao hơn (10µg/ml và 100µg/ml) không ảnh hưởng đến số lượng tinh thể hình thành nhưng dạng tinh thể chủ yếu là dạng COD. Ngược lại, phân đoạn n-hexan, với cả hai nồng độ thấp lại làm tăng số lượng tinh thể calci oxalat, đồng thời làm giảm dần kích thước tinh thể tạo thành theo chiều giảm nồng độ.
- Trên OD620nm: Trong số bốn phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70%, có ba phân đoạn thể hiện tác dụng ức chế thành tinh thể calci oxalat là chloroform, ethyl acetat và phân đoạn nước còn lại. Trong đó, tác dụng mạnh nhất là phân đoạn chloroform với 31,39% (nồng độ 1µg/ml), sau đó tác dụng giảm nhanh còn 24,52% (nồng độ 10µg/ml) và không còn tác dụng ở nồng độ 100µg/ml. Xu hướng tác dụng này tương tự phân đoạn ethyl acetat nhưng phân đoạn ethyl acetat thể hiện tác dụng yếu hơn (9,33% ở nồng độ 1µg/ml). Phân đoạn nước còn lại có lỷ lệ ức chế cao nhất là 25,59% (nồng độ 10µg/ml). Riêng phân đoạn n-hexan không thể hiện tác dụng ức chế số lượng tinh thể tạo thành.
- Trên hình ảnh tinh thể: Ba phân đoạn n-hexan, chloroform và ethyl acetat có xu hướng tương tự nhau: với nồng độ thấp nhất (1µg/ml) làm giảm số lượng tinh thể tạo thành so với mẫu trắng tinh thể. Khi tăng nồng độ thì số lượng tinh thể tăng lên, trong đó phân đoạn n-hexan ở nồng độ 100µg/ml làm tăng nhiều nhất số lượng tinh thể caci oxalat, kích thước tinh thể cũng nhỏ nhất. Phân đoạn nước còn lại có xu hướng khác với ba phân đoạn trên. Ở nồng độ thấp nhất, tinh thể tạo thành nhiều nhất và nhiều hơn mẫu trắng tinh thể, với hai nồng độ cao hơn (10µg/ml và 100µg/ml), tinh thể tạo thành hầu như không thay đổi so với mẫu trắng tinh thể về cả số lượng, kích thước tinh thể và tỷ lệ dạng COD/COM.
3.3. Bàn luận
3.3.1. Về đặc điểm hình thái, đặc điểm vi học của hai loài D. heterophyllum (Willd.) DC. và D. triflorum (L.) DC.
Loài D.heterophyllum (Willd.) DC. và loài D.triflorum (L.) DC. có đặc điểm hình thái gần giống nhau nên trong quá trình thu hái để làm thuốc thường bị thu hái lẫn và sử dụng lẫn với nhau. Trong khi D.triflorum (L.) DC. đã được sử dụng làm thuốc ở nhiều nước và có nghiên cứu về tác dụng sinh học như: tác dụng kháng khuẩn [29], tác dụng chống viêm, giảm đau [29], tác dụng chống oxy hóa [30] thì
D. heterophyllum (Willd.) DC. lại chưa được nghiên cứu nhiều cả về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học.
Do vậy để phân biệt hai loài này nhằm tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu, tránh nhầm lẫn trong quá trình thu hái và sử dụng thì việc nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm vi học có ý nghĩa quan trọng.
- Về đặc điểm hình thái: Những điểm giống và khác nhau cơ bản giữa D. heterophyllum (Willd.) DC. và D. triflorum (L.) DC. được thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.15.
- Về đặc điểm bột: Bộ phận sử dụng của hai loài D. heterophyllum (Willd.) DC. và D. triflorum (L.) DC. là toàn bộ phần trên mặt đất nên khi soi bột dược liệu thấy có rất nhiều đặc điểm và các đặc điểm này giống nhau giữa hai loài.
- Về đặc điểm vi phẫu thân và lá: Quan sát trên kính hiển vi thấy vi phẫu thân và lá của hai loài D. heterophyllum (Willd.) DC. và D. triflorum (L.) DC. chỉ khác nhau về kích thước, giống nhau về hình dạng và cấu tạo.
Bảng 3.6. Những điểm giống và khác nhau về đặc điểm hình thái giữa hai loài D.