Trong dân gian có một số bài thuốc sử dụng dược liệu Hàn the [1], [10], [13]. Tuy nhiên do hai loài D. heterophyllum (Willd.) DC. và D.triflorum (L.) DC. khá giống nhau về đặc điểm hình thái nên thực tế người dân thường sử dụng lẫn và gọi tên chung hai loài này là Hàn the. Một số bài thuốc dân gian có sử dụng Hàn the để điều trị các chứng bệnh như:
+ Sốt, viêm đường tiết niệu: Hàn the 40g, Lá tre 40g, thân cây Sậy 40g. Nấu sắc uống.
+ Phù thiểu niệu do suy tim, suy thận: Hàn the 30g, lá Mã đề 30g, Cam thảo đất 30g. Nấu sắc uống.
+ Chữa kiết lỵ ra máu nhiều: Hàn the (tươi hoặc khô), Cỏ seo gà, Rau má, Cỏ sữa; mỗi thứ 20g, sắc 3 bát nước còn 1 bát uống 1 lần; ngày sắc uống 4 - 5 lần.
+ Chữa bí tiểu tiện, tiểu tiện ra máu: Hàn the 30g, Mộc tặc 30g, hai vị để tươi,thái nhỏ sao vàng cho thơm, sắc với 400ml nước còn 100ml, uống làm 2 lần trong ngày. + Chữa đái buốt, đái rắt: cả cây Hàn the 30g, Củ gai 30g, giã nhỏ chế lấy nước, vắt lấy nước cốt, uống trong ngày. Hoặc dùng hai thứ bằng nhau, mỗi vị một nắm sắc uống.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu
Mẫu dược liệu gồm toàn bộ cây mang lá, hoa, quả của hai loài nghiên cứu được thu hái ở Hải Dương vào tháng 9 và tháng 11năm 2012.
Dược liệu sau khi làm sạch, được sấy khô ở nhiệt độ dưới 60°C, tán nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo.
Mẫu dược liệu được DS. Nghiêm Đức Trọng - Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội giám định tên khoa học là Desmodium heterophyllum
(Willd.) DC. và Desmodium triflorum(L.) DC., họ Đậu (Fabaceae).
2.1.2. Hóa chất, dung môi
- Dung môi: ethanol, chloroform, ethylacetat, n-hexan, nước.
- Hóa chất: Natri clorid (NaCl), kali clorid (KCl), dinatri hydrophosphat (Na2HPO4), amoni sulfat ((NH4)2SO4), amoni clorid (NH4Cl), magie clorid (MgCl2), natri citrat (Na3C6H5O7), calci clorid (CaCl2), acid oxalic dihydrat (H2C2O4.2H2O), cloramin B, cloralhydrat, acid acetic, đỏ carmin, xanh methylen, glycerin.
- Các hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
- Thiết bị dùng cho nghiên cứu tác dụng dược lý: Máy cất nước 2 lần Hmillton, Hoa kỳ; máy lọc nước RO Arium 611 Sartorius, Đức; thiết bị khuấy từ Heidolph, Đức; máy điều chỉnh pH Euteck instruments pH 510, Singapore; bản nhọn 96 giếng; máy lắc Vortex Genius 3 IKA, Đức; máy đọc khay vi tinh thể Biotek, Mỹ; máy ủ lắc Star- Fax - 2200 Awareness Technology, Mỹ kết nối máy tính Sunpac của Phúc Anh, Việt Nam; tủ ấm Memmert, Đức; kính hiển vi Olympus CKX41 kết nối với máy ảnh Canon, Nhật; pipet 1 đầu côn loại 10-100µl và loại 100-1000µl; pipet 8 đầu côn loại 10-100µ và loại 10-300µl; máy cất quay Rotavapor R-200, máy ly tâm Harmonic Series, máy đo độ ẩm Sartorius, pipet Pasteur, pipet chính xác, bình nón, bình gạn…
- Thiết bị dùng cho nghiên cứu đặc điểm vi học: Phiến kính, lamen, dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay, kính hiển vi có gắn máy ảnh, trắc vi vật kính và trắc vi thị kính.
- Một số thiết bị khác: cân phân tíchPrecisa, cân kỹ thuật Sartorius, tủ sấy…
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật
Nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm bột và vi phẫu của lá, thân hai loài
Desmodium heterophyllum ( Willd.) DC. và Desmodium triflorum (L.) DC.
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của hai loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC. và Desmodium chiết của hai loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC. và Desmodium triflorum (L.) DC. trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro
- Chuẩn bị dịch chiết toàn phần bao gồm: dịch chiết nước và dịch chiết ethanol 70%.
- Từ dịch chiết ethanol 70%, chiết xuất các phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat và phần nước còn lại sau khi lắc với các dung môi hữu cơ này.
- Đánh giá ảnh hưởng của các dịch chiết và phân đoạn dịch chiết lên sự hình thành tinh thể calci oxalat trên mô hình tạo tinh thể calci oxalat in vitro ở bản nhựa 96 giếng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Xử lý và bảo quản mẫu
Mẫu dược liệu là dược liệu tươi và dược liệu đã qua phơi khô sau khi thu hái. Dược liệu được bảo quản cụ thể như sau:
- Mẫu dược liệu cắt vi phẫu dùng mẫu tươi hoặc khô bảo quản trong dung dịch ethanol 50%.
- Mẫu dược liệu dùng soi bột được sấy khô, nghiền thành bột mịn, bảo quản trong lọ có nút kín,ghi nhãn để nơi khô ráo.
- Mẫu dược liệu dùng để nghiên cứu tác dụng dược lý được thái nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ < 60°C, bảo quản nơi khô ráo.
2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm thực vật
Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái thực vật tại thực địa; chụp ảnh; thu hái; làm tiêu bản dược liệu.
2.3.2.2. Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu
Tiến hành làm tiêu bản vi phẫu như sau: - Chọn phần mẫu thích hợp.
- Cắt tiêu bản bằng dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay.
- Xử lý lát cắt: Lựa chọn những lát cắt mỏng, tẩy bằng dung dịch cloramin B, rửa sạch bằng nước, tẩy tiếp bằng cloralhydrat 75%, rửa lại bằng nước, ngâm trong acid acetic 5%, rửa bằng nước đến hết acid. Sau đó tiến hành nhuộm kép với đỏ carmin và xanh methylen.
- Quan sát, mô tả và chụp ảnh: lên tiêu bản bằng dung dịch glycerin rồi quan sát dưới kính hiển vi, mô tả đặc điểm giải phẫu, chụp ảnh bằng kính hiển vi có gắn máy ảnh.
2.3.2.3. Nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu
- Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi để xác định màu, mùi, vị.
- Lên tiêu bản bột dược liệu bằng nước cất, quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột trên kính hiển vi có gắn máy ảnh. Sử dụng trắc vi vật kính và trắc vi thị kính để đo một số đặc điểm bột dược liệu. Ảnh các đặc điểm được chuyển vào máy tính, ghép thành ảnh hoàn chỉnh.
2.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch
chiết của hai loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC. và Desmodium triflorum (L.) DC. trên hình thành tinh thể calci oxalat in vitro
- Ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của 2 loài Desmodium Desv. được đánh giá trên mô hình tạo tinh thể calci oxalat in vitro trên bản nhựa 96 giếng theo mô tả bởi Gohel MD và Wong SP [23].
- Nguyên tắc của mô hình là tạo tinh thể calci oxalat in vitro trong môi trường nước tiểu nhân tạo, theo dõi sự hình thành tinh thể và khả năng ức chế hình thành tinh thể của dược liệu thông qua việc xác định mật độ quang ở bước sóng
620nm (OD620nm), quan sát và chụp ảnh tinh thể calci oxalat tạo thành trong các giếng dưới kính hiển vi soi nổi.
2.3.3.1. Chuẩn bị dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết
- Dịch chiết nước:
Dịch chiết nước thu được bằng phương pháp sắc (5gam dược liệu trong 50ml nước cất, sắc 3 lần, mỗi lần 30 phút). Dịch chiết nước sau đó được cô đặc đến dạng cao lỏng 1:1 (1ml tương ứng với 1gam dược liệu khô). Để thử tác dụng dược lý, cao lỏng được pha loãng với nước thành các dung dịch có độ pha loãng 1/2; 1/4; 1/8; 1/16.
- Dịch chiết ethanol 70%:
Dịch chiết ethanol 70% thu được bằng phương pháp chiết hồi lưu (50gam dược liệu chiết với 500ml ethanol 70%, chiết hồi lưu 3 lần, lần đầu tiên trong 1 giờ, 2 lần sau mỗi lần 30 phút). Bay hơi dung môi đến khi còn lại 50ml (1ml tương ứng với 1gam dược liệu khô). Dịch chiết 1:1 này được lọc và pha loãng với nước cất thành các dung dịch có độ pha loãng 1/2; 1/4; 1/8; 1/16.
- Chiết xuất các phân đoạn:
Các phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% được chiết xuất bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan, chloroform, ethyl acetat. Bay hơi dung môi thu được các cắn phân đoạn. Phần nước còn lại sau khi lắc với dung môi hữu cơ cũng được cô đặc đến cắn. Cắn được cân và pha với dung môi thích hợp tạo thành các dung dịch có nồng độ 10µg/ml, 100µg/ml, 1000µg/ml.
Hình 2.1.Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% của hai loài D. heterophyllum (Willd.) DC. và D. triflorum (L.) DC.
Dịch chiết EtOH 70% Cao lỏng 1:1 Lớp n-hexan Lớp CHCl3 Cắn CHCl3 Lớp nước
+ EtOH 70% (chiết hồi lưu 3lần/2 giờ), lọc
+ Cất thu hồi dung môi dưới áp lực giảm rồi cô đặc
Lớp nước + CHCl3
Cất thu hồi dung môi dưới áp lực giảm
Cắn n- hexan + n- hexan
Cất thu hồi dung môi dưới áp lực giảm + EtOAc Lớp nước Lớp EtOAc Cắn nước + Cô đặc Cắn EtOAc
Cất thu hồi dung môi dưới áp lực giảm
2.3.3.2. Chuẩn bị nước tiểu nhân tạo, dung dịch acid oxalic và dung dịch chứng dương natri citrat
• Chuẩn bị dung dịch nước tiểu nhân tạo:
Dung dịch nước tiểu nhân tạo được pha theo công thức của Kavanagh và cộng sự (1990) [27] và có điều chỉnh để phù hợp với mô hình trên bản nhựa 96 giếng như sau:
Bảng 2.1.Thành phần nước tiểu nhân tạo theo Kavanagh và cộng sự [27]
Thành phần Đơn vị (mmol/l) NaCl 368,0 KCl 188,825 Na2HPO4 57,5 (NH4)2SO4 50,375 NH4Cl 8,05 MgCl2 7,5 Natri citrat 5,0 CaCl2 15,0
Dung môi sử dụng để pha nước tiểu nhân tạo là nước cất 2 lần được lọc qua máy lọc RO, làm ấm đến 37°C, hòa tan lần lượt các thành phần và được điều chỉnh pH bằng dung dịch HCl 1N đến pH 6, sau đó để ổn định ở 37°C.
• Chuẩn bị dung dịch acid oxalic:
Pha dung dịch acid oxalic dihydrat 0,04N, để ổn định ở 37°C.
• Chuẩn bị dung dich chứng dương natri citrat (ký hiệu CD):
Pha dung dịch Natri citrat dihydrat nồng độ 150mM, để ổn định ở 37°C.
a. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol 70% trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitrocủa hai loài nghiên cứu
Để đánh giá ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol 70% với các độ pha loãng 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 thí nghiệm được tiến hành trên 12 lô, mỗi lô 8 giếng của bản nhựa 96 giếng. Thành phần cho vào mỗi giếng của từng lô như sau:
+ 1 lô trắng tinh thể: 160μl nước tiểu nhân tạo + 20μl nước + 20μl dung dịch acid oxalic.
+ 1 lô chứng dương: 160μl nước tiểu nhân tạo + 20μl dung dịch natri citrat + 20μl dung dịch acid oxalic.
+ 5 lô trắng mẫu thử: 160μl nước tiểu nhân tạo + 20μl nước + 20μl dung dịch mẫu thử.
+ 5 lô thử: 160μl nước tiểu nhân tạo + 20μl dung dịch mẫu thử + 20µl dung dịch acid oxalic.
b. Đánh giá ảnh hưởng của cắn phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro
+ Khảo sát ảnh hưởng của dung môi ethanol trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro
Để đánh giá ảnh hưởng của các cắn phân đoạn trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro, ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol sử dụng để hòa tan cắn đến sự hình thành tinh thể cần được khảo sát để lựa chọn nồng độ phù hợp.
Thí nghiệm được bố trí đánh giá ảnh hưởng của dung môi ethanol ở các nồng độ 80%, 50%, 20%, 10% và 5% (thể tích/thể tích) trước khi cho vào giếng song song với mẫu trắng tạo tinh thể trong môi trường nước. Cách tiến hành như phần a.
+ Đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết
Thí nghiệm bố trí tương tự phần a với 8 lô, mẫu thử là cắn các phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% được hòa tan trong ethanol ở nồng độ thích hợp để thu được các dung dịch có nồng độ 10µg/ml, 100µg/ml, 1000µg/ml. Với lô trắng tinh thể, 20µl nước được thay thế bằng 20µl dung dịch ethanol có cùng nồng độ với ethanol
pha cắn và lô chứng dương natri citrat cũng được hòa tan trong ethanol có cùng nồng độ.
c. Đánh giá kết quả
Xác định mật độ quang OD620nm ở bước sóng 620nm tại thời điểm 5 phút sau khi thêm acid oxalic vào hỗn hợp trong giếng để tạo tinh thể. Giá trị trung bình ODTB của mỗi lô là trung bình cộng giá trị OD620nm của 8 giếng trong mỗi lô. Phần trăm ức chế (%UC) hình thành tinh thể calci oxalat của chất thử được tính theo công thức:
% UC = a-(c-b)
a x100
a: ODTB mẫu trắng sỏi.
b: ODTB mẫu trắng dung dịch thử.
c: ODTB mẫu tạo tinh thể khi có mặt dung dịch thử.
+ Nếu %UC > 0: chất thử có tác dụng ức chế quá trình hình thành tinh thể calci oxalat.
+ Nếu %UC ≤ 0: chất thử không có tác dụng ức chế số lượng tinh thể calci oxalat. Trong trường hợp này, chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của chất thử lên quá trình tạo tinh thể là ΔOD = c-b-a. Đây là độ đục tăng thêm do số lượng tinh thể tăng lên khi có mặt chất thử so với mẫu trắng tinh thể.
Ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết hai loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC. và Desmodium triflorum(L.) DC. được đánh giá trên hai thông số:
- Giá trị phần trăm ức chế (%UC) hình thành tinh thể calci oxalat hoặc ΔOD. - Hình ảnh tinh thể calci oxalat được quan sát dưới kính hiển vi sau khi kết thúc thí nghiệm, bao gồm: số lượng, kích thước tinh thể calci oxalat và tỷ lệ dạng tinh thể COD/COM.
2.3.3.4. Xử lý số liệu
Số liệu được lưu giữ và xử lý bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007. Mẫu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Sử dụng test kiểm
định ANOVA với phân tích hậu kiểm (post- hoc) Dunnette để so sánh sự khác biệt và giá trị trung bình giữa các mẫu. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của hai loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC. và Desmodium triflorum (L.) DC. (Willd.) DC. và Desmodium triflorum (L.) DC.
3.1.1. Đặc điểm hình thái
3.1.1.1. Loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC.
Cây thảo, mọc bò lan trên mặt đất, thân tròn, phần non có nhiều lông mịn, phân nhánh nhiều. Lá kép gồm 3 lá chét, lá ở gốc cành thường là 1 lá chét đơn độc, phiến lá thuôn hình bầu dục, dài 1 - 1,5cm, mép lá nguyên. Lá mang ít lông ở mặt trên và nhiều lông ở mặt dưới. Hoa mọc đơn độc hoặc thành từng đôi ở nách lá, đài có lông hình móc câu, chia 5 thùy. Tràng hoa màu hồng tím. Quả loại đậu thẳng hoặc hơi cong, mép trên thẳng, mép dưới lượn sóng, chia 3 - 5 đốt, mỗi đốt chứa 1 hạt, hạt có hình hạt đậu, màu vàng.
3.1.1.2. Loài Desmodium triflorum (L.) DC.
Cây thảo, mọc bò lan trên mặt đất, thân tròn, phần non có nhiều lông, phân nhánh rất nhiều. Lá kép gồm 3 lá chét, phiến lá hình trứng ngược, có khi gần hình tim, dài 0,5 - 0,8cm; mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt và có nhiều lông. Hoa mọc đơn độc hoặc thành từng đôi ở nách lá, đài hoa chia 5 thùy, tràng hoa màu xanh tím. Quả loại đậu thẳng hoặc hơi cong, chia 3 - 5 đốt, mỗi đốt chứa 1 hạt, hạt có hình hạt đậu, màu vàng.
2 1
Hình 3.1.Ảnh chụp hai loài D. heterophyllum (Willd.) DC. (1) và D. triflorum (L.) DC. (2) tại thực địa
Hình 3.2. Ảnh chụp phần trên mặt đất loài D. heterophyllum (Willd.) DC. (1) và loài D. triflorum (L.) DC. (2)
Hình 3.3.Ảnh chụp hoa (3), quả (4) loài D. heterophyllum (Willd.) DC. và hoa (5), quả (6) loài D. triflorum (L.) DC
1 2 3 5 4 6
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu
3.1.2.1. Đặc điểm vi phẫu thân
Vi phẫu thân của hai loài D. heterophyllum (Willd.) DC. và D. triflorum (L.) DC. chỉ khác nhau về kích thước vì đường kính thân D. heterophyllum (Willd.) DC. lớn hơn so với đường kính thân D. triflorum (L.) DC.. Còn về cấu tạo thân của hai loài này giống nhau với những đặc điểm như sau:
Mặt cắt ngang có tiết diện tròn. Quan sát từ ngoài vào trong thấy: ngoài cùng