3.2.1.1. Định tính alkaloid
Cho khoảng 5g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dược liệu bằng dd. amoniac đặc. Đậy kín bình trong vòng 30 phút. Cho 25ml chloroform lắc đều, ngâm 12 giờ. Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn. Sau đó lắc kỹ 2 lần, mỗi lần với 10ml dd. H2SO4 1N. Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết acid.
Ống 1: Nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử Mayer
Ống 2: Nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử Dragendroff
18 Thực hiện các bước tương tự với cả 3 mẫu.
Kết quả: với cả 3 mẫu dược liệu đều thu được kết quả như sau:
Ống 1: có tủa trắng.
Ống 2: có tủa da cam.
Ống 3: có tủa nâu.
Kết luận: Rễ Bá bệnh có alkaloid.
3.2.1.2. Định tính saponnin
+ Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Cho 0,5g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước đun sôi nhẹ, lọc nóng. Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước, lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc ống nghiệm. Để yên 15 phút.
Kết quả: Quan sát thấy cột bọt bền sau khi ngừng lắc 15 phút đối với cả 3
mẫu.
+ Phản ứng Rosenthaler:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết nước, thêm 1ml vanilin 1% trong cồn và vài giọt H2SO4 đặc. Quan sát thấy dung dịch có màu tím hoa cà ở cả 3 mẫu.
+ Phản ứng phân biệt 2 saponin:
Cho vào ống nghiệm to 0,5g bột dược liệu, thêm 5ml EtOH 90%, đun cách thủy đến sôi, lọc nóng. Lấy dịch lọc làm thí nghiệm sau:
- Ống 1: cho 5ml dd. NaOH 0,1N thêm 5 giọt dịch lọc trên. - Ống 2: 5ml dd. HCl 0.1N thêm 5 giọt dịch lọc trên.
Lắc đều 2 ống nghiệm trong 1 phút. Để yên, thấy cột bọt ở ống 1 cao hơn ống 2 với cả 3 mẫu dược liệu.
Sơ bộ kết luận: dược liệu có chứa saponin triterpenoid.
19
3.2.1.3. Định tính flavonoid
Cho 5g bột dược liệu vào bình nón, thêm 50ml EtOH 90%, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng:
+ Phản ứng Cyanidin:
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại, rồi cho 4 – 5 giọt acid HCl đặc. Đun cách thủy vài phút không thấy dung dịch chuyển từ vàng sang hồng (ở cả 3 mẫu).
+ Phản ứng với kiềm:
Phản ứng với NH3 : Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút thấy màu vàng của vết dịch chiết không thay đổi ở cả 3 mẫu.
Phản ứng với NaOH : cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy màu vàng của dịch chiết không thay đổi ở cả 3 mẫu.
+ Phản ứng với FeCl3 5% :
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2 – 3 giọt dd. FeCl3 5% không thấy xuất hiện màu xanh đen ở cả 3 mẫu.
+ Phản ứng với AlCl3 3% trong cồn :
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2 – 3 giọt dd. AlCl3 % trong cồn không thấy xuất hiện màu xanh ở cả 3 mẫu.
Kết luận: Trong rễ cây bá bệnh không có flavonoid.
3.2.1.4. Định tính anthranoid
+ Phản ứng Borntrager:
Cho 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml dd. H2SO4
10%. Đun sôi cách thủy trong 15 phút. Lọc nóng vào bình gạn. Để nguội rồi lắc với 5ml ether ethylic. Gạn lấy phần ether cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết.
20 - Ống 1: Thêm 1ml dd. NH4OH 10% - Ống 2: Thêm 1ml dd. NaOH 10% Thực hiện tương tự với cả 3 mẫu dược liệu.
Kết quả: Quan sát thấy lớp nước có màu vàng nhạt ở cả 2 ống nghiệm đối
với cả 3 mẫu dược liệu.
+ Vi thăng hoa:
Cho 1g bột dược liệu trên nắp nhôm. Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi bay hết hơi nước trong dược liệu. Đặt lên miệng nắp nhôm một lam kính, trên lam kính có để một miếng bông tẩm nước lạnh. Đốt nắp nhôm trên ngọn lửa đèn cồn. Sau 5 – 10 phút lấy lam kính ra để nguội. Soi dưới kính hiển vi. Thực hiện tương tự đối với 3 mẫu dược liệu.
Kết quả: Soi dưới kính hiển vi không thấy tinh thể ở cả 3 mẫu. Kết luận: Dược liệu không có anthranoid.
3.2.1.5. Định tính glycosid tim
Cho 10g bột dược liệu vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 60ml EtOH 20%, lắc đều, ngâm qua đêm. Lọc lấy dịch chiết, loại tạp (chất nhầy, chất nhựa) bằng chì acetat 30% để dư. Để lắng, lọc. Loại chì acetat dư bằng dd. Na2SO4 bão hòa đến khi không còn tủa với Na2SO4 nữa. Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 2 lần với chloroform, mỗi lần 20ml, để lắng, gạn lấy dịch chiết, loại nước bằng cách lọc qua bông. Cho dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ, đem cô cách thủy đến khô. Cắn thu được để làm các phản ứng:
+ Phản ứng Baljet:
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml EtOH 90%, lắc đều cho cắn được hòa tan hết, thêm 0,5ml thuốc thử Baljet mới pha (gồm 1 phần dd. Acid picric 1% và 9 phần dd. NaOH 10%).
21
+ Phản ứng Liebermann:
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho đến khi tan hết cắn. Đặt nghiêng ống nghiệm 450, thêm từ từ theo thành ống nghiệm 1ml dd. H2SO4 đặc để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành hai lớp.
Kết quả: Quan sát thấy mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng có màu tím đỏ
ở cả 3 mẫu. Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng Legal:
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml EtOH 90%, lắc đều cho tan hết cắn thêm 5 giọt dd. natri nitroprussiat 1% và 2 giọt dd. NaOH 10%, lắc đều.
Kết quả: Xuất hiện màu đỏ ở cả 3 mẫu. Phản ứng dương tính. Kết luận: cả 3 mẫu dược liệu có chứa glycosid tim.
3.2.1.6. Định tính coumarin
Cho 3g bột dược liệu vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 30ml EtOH 90%. Đun cách thủy 5 phút. Lọc nóng. Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng sau:
Phản ứng mở đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 1ml dịch chiết:
Ống 1: Thêm 0,5ml dd. NaOH 10%.
Ống 2: Để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội. Quan sát thấy:
Ống 1: Có tủa đục.
Ống 2: Trong suốt.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều, rồi quan sát thấy:
Ống 1: Trong suốt.
Ống 2: Có tủa đục.
22
Kết quả: Với cả 3 mẫu hiện tượng quan sát được đều như trên. Phản ứng
dương tính.
Phản ứng Diazo hóa:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vào đó 2ml dd. NaOH 10% đun cách thủy sôi 3 – 5 phút rồi để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha.
Kết quả: Có màu đỏ gạch với cả 3 mẫu.
Quan sát huỳnh quanh của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (PƯ chuyển dạng đồng phân từ cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại).
Nhỏ vài giọt dịch chiết coumarin lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dd. NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (đồng xu, chìa khóa…) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra soi tiếp dưới đèn tử ngoại sẽ thấy: phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che. Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại phần bị che sẽ sáng dần lên, sau vài phút cả hai phần đều phát quang như nhau.
Kết quả thu được đều tương tự ở cả 3 mẫu.
Kết luận: Dược liệu có chứa coumarin.
3.2.1.7. Định tính tanin
Cho vào ống nghiệm lớn 1g bột dược liệu, thêm 10ml nước cất, đun sôi trực tiếp 5 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:
Ống 1: 1ml dịch lọc + vài giọt dd. FeCl3 5% Ống 2: 1ml dịch lọc + vài giọt dd. chì acetat 10% Ống 3: 1ml dịch lọc + vài giọt dd. đồng acetat 10% Ống 4: 1ml dịch lọc + 1ml dd. gelatin 1%
23 Ống 1: Không xuất hiện tủa xanh đen. Ống 2: Không xuất hiện kết tủa bông. Ống 3: Không thấy xuất hiện tủa.
Ống 4: Không xuất hiện tủa bông trắng.
Kết luận: Dược liệu không có tannin.
3.2.1.8. Định tính chất béo, steroid
Cho 10g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50ml, đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm, lọc.
Chất béo: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hết dung
môi.
Kết quả: Không thấy để lại vết mờ trên giấy lọc ở cả 3 mẫu. Phản ứng âm
tính.
Steroid: cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết trên, bốc hơi dung môi đến
khô, thêm vào ống nghiệm 1ml anhydride acetic. Lắc kỹ rồi để nghiêng ống nghiệm 450, thêm 1ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. Quan sát mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng.
Kết quả: Mặt phân cách có màu đỏ nâu đối với cả 3 mẫu. Kết luận: Dược liệu có Steroid, không có chất béo.
3.2.1.9. Định tính acid hữu cơ
Cho 1g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất. Đun sôi trực tiếp 10 phút trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lọc. Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể NaCO3 thấy có bọt khí bay lên.
Kết quả thu được từ 3 mẫu dược liệu là như nhau.
Kết luận: Dược liệu có acid hữu cơ. 3.2.1.10. Định tính acid amim
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết nước, thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 5% đun cách thủy 5 phút.
24
Kết quả: Quan sát thấy xuất hiện màu tím ở cả 3 mẫu dược liệu. Phản ứng
dương tính.
Kết luận: Dược liệu có acid amin. 3.2.1.11. Định tính đường khử
Cho 2g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10ml nước cất, đun cách thủy sôi 5 phút, lọc nóng. Cho 2ml dịch chiết nước vào ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A, 3 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy 10 phút.
Kết quả: Không xuất hiện kết tủa đỏ gạch ở cả 3 mẫu. Phản ứng âm tính.
Kết luận: Dược liệu không có đường khử.
3.2.1.12. Định tính polysaccharid
Cho 2g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10ml nước cất, lắc đều. Đun sôi cách thủy 5 phút, lọc lấy dịch chiết làm phản ứng:
Ống 1: 4ml dịch chiết thêm 5 giọt thuốc thử Lugol. Ống 2: 4ml nước cất thêm 5 giọt thuốc thử Lugol.
Kết quả: với cả 3 mẫu đều có hiện tượng:
Ống 1: có màu tím than. Ống 2: có màu vàng nhạt.
25
Bảng 3.2: Kết quả định tính các nhóm chất trong 3 mẫu rễ cây Bá bệnh
Stt Nhóm chất PƯ ĐT Kết quả Kết luận Mẫu QN Mẫu TN Mẫu
KH Mẫu QN Mẫu TN Mẫu KH
1 alkaloid TT Mayer ++ ++ ++ Có Có Có TT Dragendorff +++ +++ +++ TT Bouchardat + + + 2 Saponin
Hiện tượng tạo bọt ++ ++ ++
Có Có Có
PƯ Rosenthaler ++ ++ ++
Phân biệt 2 loại saponin Saponin triterpenoid Saponin triterpenoid Saponin triterpenoid 3 Coumarin PƯ đóng mở vòng lacton +++ +++ +++ Có Có Có PƯ TT diazo + + + PƯ chuyển từ ĐP cis sang trans dưới td của UV 366nm Phần bị che bởi miếng kim loại mờ hơn phần không bị che Phần bị che bởi miếng kim loại mờ hơn phần không bị che Phần bị che bởi miếng kim loại mờ hơn phần không bị che 4 Glycosid tim PƯ Liebermann +++ +++ +++ Có Có Có PƯ Baljet + + + PƯ Legal + + + 5 Flavonoid PƯ Cyanidin - - -
Không Không Không
PƯ với kiềm - - -
PƯ với FeCl3 5% - - -
PƯ với AlCl3 3%
trong cồn - - -
6 Anthranoid PƯ Borntraeger - - - Không Không Không
Vi thăng hoa - - -
7 Tannin
PƯ FeCl3 5% - - -
Không Không Không
PƯ Pb(CH3COO)2 - - -
PƯ Cu(CH3COO)2 - - -
PƯ dd gelatin 1% - - -
8 Acid hữu cơ PƯ Na2CO3 + + + Có Có Có
9 Acid amin PƯ TT ninhydrin
5% ++ ++ ++ Có Có Có
10 Đường khử PƯ TT Fehling - - - Không Không Không
11 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - - - Không Không Không
12 Steroid PƯ liebermann +++ +++ +++ Có Có Có
13 Polysaccharid PƯ TT Lugol ++ ++ ++ Có Có Có
Quy ước:
(-) Phản ứng âm tính. (+) Phản ứng dương tính.
(++) Phản ứng dương tính rõ.
26