1.4.1. P h ư ơ n g p h á p sắc k ỉ bản m ỏ n g
Sắc kí bản mỏng được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm. Thông thường sản phẩm với giá trị R f khác nhau m àu sắc và sự phát quang khác nhau... Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng xảy ra, không xảy ra, kết thúc phản ứng.
Phương pháp sắc kí lớp mỏng gồm pha tĩnh là 1 lớp m ỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel 6OF254, aluminum oxide được phủ trên một m ặt phang chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và được hút lên sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch.
Dùng mao quản chấm một vết nhỏ dung dịch nguyên liệu đầu, một vệt là sản phản phản ứng khoảng lcm từ dưới lên. Bản sắc kí sau đó được nhúng vào một hệ dung môi thích hợp n-hexan/EtO A c được đặt trong bình triển khai. Dung môi được chuyển lên bản sắc kí gặp phải mẫu thử và dung dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí. Các chất với R f khác nhau dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau với pha tĩnh và độ tan khác nhau trong dung môi. Hợp chất có tính phân cực sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc kí. Đối với những chất có u v ta kiểm tra u v có thể nhận được các vết khác nhau. Dựa vào các vết trên bản m ỏng cùng với giá thị R f tương ứng ta có thể nhận biết được phản ứng đã xảy ra hay chưa, nguyên liệu đầu còn hay hết.
Dựa vào tính chất đó chúng ta có thể tìm được dung môi hoặc hỗn hợp dung môi để các chất tách ra khỏi nhau (R f khác nhau) tìm được hệ dung môi cần để tinh chế các chất.
Có thể sử dụng m ột hỗn hợp hai dung môi. Trong hai dung môi đó m ột dung môi có khả năng hòa tan tốt chất kết tinh còn dung môi kia thì ngược lại hoặc ít tan. Hỗn hợp hai dung môi này phải hòa tan vào nhau tạo thành một dung dịch đồng nhất trong suốt.
trong benzen, ete, dầu, n-hexan. Thường dung môi có nhiệt độ sôi từ 60°c - 80°c là thích hợp.
1.4.2. Chiết
Chiết là quá trình tách và phân li các chất dựa vào quá trình chuyển m ột chất hòa tan trong một pha lỏng (thường là nước) một pha lỏng khác không hòa tan vào nó (thường là dung môi hữu cơ không hòa tan với nước). N hư vậy ta có quá trình chiết lỏng.
Chiết là phương pháp có ứng dụng rất có hiệu quả vào các mục đích tách, phân ly, làm giàu các chất đặc biệt khi cần tách m ột lượng nhỏ các tạp chất ra khỏi một lượng lớn các chất khác. Ưu điểm của quá trình là thực hiện nhanh. Các thiết bị chiết đơn giản chỉ là phễu chiết thường người ta không cần thiết bị gi thêm.Chọn được dung môi (dung môi chiết C H2CI2) và điều kiện chiết thích hợp với chất thử người ta có thể tách được bất kì cấu từ nào ra khỏi hỗn hợp bất kì. Trường hợp chất chiết có màu ta có thể sử dụng phần chiết vào mục đích phân tích định lượng theo các phương pháp đo quang.
1.4.3. L oại bỏ d ung m ô i ỏ' áp su ấ t thấp
Dùng m áy cất quay chân không. Sau khi loại bỏ dung môi để thu được chất khô hoàn toàn ta dùng m áy hút chân không hút làm khô chất.
1.4.4. Sắc k ỉ cột
N guyên tắc sắc kí cột dựa trên ái lực hấp phụ khác nhau của các chất thử đối với chất hấp phụ để tách các chất riêng ra. N hưng trong sắc kí cột, chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong ống hình trụ và vì thế mà gọi là sắc kí cột. Với cột hấp phụ người ta có thể triển khai một dung môi liên tục, hoặc một hệ thống các dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh.
Dụng cụ chủ yếu là cột để nhồi chất hấp phụ để làm thành cột kí. Cột có thể là những ống hình trụ dài 30 - lOOcm, đường kính từ 1 - 8cm tùy theo chiều dài cột tỉ lệ giữa đường kính.
1.4.5. P h ư ơ n g p h á p n hồi cột huyền p h ù
Cột đem dùng phải thật sạch, khi đối với chất hấp phụ là nhôm oxit, có thể dùng phương pháp nhồi cột khô, nghĩa là lắp cột thẳng đứng, chắc chắn.
Đổ lượng AI2O3 qua phễu, theo m ột ống đổ vào đáy cột. Rót từ từ đều đặn để tạo nên một cột liên tục đều đặn, bằng phang không có chỗ rỗng, chỗ dày, chỗ mỏng sau khi rót hết chất nhồi vào cột người ta có thể dùng một đũa thủy tinh đầu gắn với m ột nút cao su và gõ nhẹ đều vào thành cột cho đến khi nhận được m ột chiều cao nhất định.
1.4.6. P h ư ơ n g p h á p lựa chọn chất hấp p h ụ và d u n g m ô i chạy cột sắc k í
1.4.6.1. Chọn chất hấp phụ
Thông thường ta sử dụng chất hấp phụ là silicagel, ngoài ra còn dùng Sephadex, sắc kí trao đổi ion.
1.4.6.2. Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí
Đe lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel ta phải dựa vào sắc kí lớp m ỏng với các bước cơ bản sau:
- Hoà tan hoàn toàn một lượng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi thích hợp. - Chuẩn bị 4+6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lượng tương đương nhau.
- Mỗi bản mỏng được chạy với loại dung môi có độ phân cực khác nhau. Tiếp theo hiện hình dưới đèn u v hoặc thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào thích hợp. Từ kết quả đó tìm được hệ dung môi (trong đó có m ột dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, (ví dụ n -h ex a n /E tO A c ) phù hợp để chạy cột sắc kí.
- Với mẫu chất được chiết từ cây cỏ (có chứa nhiều chất từ không phân cực đến phân cực), lựa chọn dung môi chạy cột ban đầu là dung môi đẩy vết kém phân cực nhất lên Rf khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc kí là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên Rf khoảng 0,2 trên bản mỏng.
Chú ý:
- Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột giống nhau.
- Dung môi ban đầu chạy cột là dung môi phù hợp đã chọn được ở trên nhưng cần điều chỉnh cho độ phân cực kém hơn một ít. Vì chất hấp phụ, ví dụ như silicagel tráng trên bản m ỏng có kích thước nhỏ hơn, độ mịn và độ chặt chẽ lớn hơn so với silicagel khi thực hiện chạy cột sắc kí.
- Đối với sắc kí cột Sephadex ta thường dùng m ột dung môi là M eOH.
ì . 4.6.3. Tỉ lệ giữa lượng mâu chất cẩn tách với kích thước cột
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lượng silicagel (chất hấp phụ) phải lớn hơn khoảng 25 - 50 lần khối lượng của mẫu chất cần tách. Với mẫu chất cần tách là những hỗn hợp chất khó tách riêng thì tỉ lệ này còn cao hơn (khoảng 100 - 200 lần).
ì . 4.6.4. Tỉ lệ giữa chiểu cao lượng silỉcagel và đường kính trong của cột sẳc kí
Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt thì chiều cao của silicagel trong cột và đường kính trong của cột cần đạt tỉ lệ khoảng 10:1.
M uốn biết lượng silicagel có phù hợp với cột hay không thì cho silicagel dạng khô (chưa có dung môi) vào cột để quan sát.
1.4.6.5. Cách nạp silicagel vào cột
Đe việc tách chất được tốt, silicagel phải được nạp vào cột m ột cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thường. Silicagel được nạp vào cột theo hai cách.
a, Nạp silicagel ở dạng sệt
Cố định cột trên giá. Neu đầu ra của cột không có lớp thuỷ tinh xốp thì ta cho một lớp bông m ỏng vào đáy để ngăn không cho silicagel chảy xuống bình hứng. Cho hệ dung môi chạy cột ban đầu vào bình đựng (cốc, ca nhựa). Cân lượng silicagel cần thiết (đã tính toán xác định được ở trên) cho vào bình đựng đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ và khuấy đều.
Lưu ỷ:
- Không nên thực hiện ngược lại nghĩa là rót dung môi vào silicagel bởi vì silicagel khi gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm vón cục, không đồng nhất.
- Lượng dung môi phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng.
- Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và m ở nhẹ khoá đế dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được dùng đế rót trở lại đầu cột).
- Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lượng, vừa rót vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
- Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần đê cột được đồng nhất.
Lưu ỷ:
- Nhất thiết không đê đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột.
- Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phang. Neu mặt thoáng chưa phang ta có thể dùng đũa thuỷ tinh khuấy phần dung môi sát mặt thoáng làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi đe yên cho silicagel lắng xuống từ từ tạo nên mặt thoáng bằng phang.
- Với sắc kí cột sephadex ta thao tác tương tự nhưng cần ngâm sephadex với dung môi một thời gian để sephadex trương nở trước khi cho vào cột.
b, Nạp silicagel dạng khỏ
- Cột được giữ thẳng đứng trên giá. Cho miếng bông nhỏ vào đáy cột (nếu cột không có lớp thuỷ tinh xốp), rót dung môi chạy cột ban đầu vào khoảng hai phần ba cột.
- Cho từ từ silicagel dạng khô vào cột qua phễu lọc, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột. Khi lớp silicagel trong cột cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ khoá và cho dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được rót trở lại đầu cột).
- Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua vài ba lần để cột được ổn định trước khi nạp mẫu vào.
- Thông thường người ta nạp silicagel vào cột ở dạng sệt.
Có hai phương pháp nạp mẫu vào cột sắc kí là phương pháp khô và phương pháp ướt.
* Phương p h á p nạp cột khô:
M ầu được nạp ở dạng khô. Thường áp dụng cho trường hợp mẫu chất không tan hoặc tan kém trong dung môi chạy cột ban đầu. Cách chuấn bị mẫu: Hoà tan hoàn toàn mẫu trong dung môi thích hợp, cho m ột lượng silicagel vừa đù (lượng silicagel cho vào càng ít càng tốt, nhưng phải đủ để có thể cô quay mẫu được khô hoàn toàn) vào rồi đem cất quay đuổi dung môi đến khô hoàn toàn. Lấy mẫu đã gắn đều trên silicagel ra, nghiền thành bột mịn. Cột sau khi nạp silicagel được điều chỉnh lượng dung môi vừa đủ (đủ thấm ướt mẫu khô cho vào). Cho mẫu vào cột qua phễu một cách từ từ để silicagel đã được gắn đều mẫu thấm đều dung môi tránh tạo bọt khí và tránh để mẫu bị vón cục.
* Phương pháp cột ướt:
Thường áp dụng khi mẫu tan hoàn toàn trong dung môi chạy cột ban đầu. Lượng dung môi dùng hoà tan mẫu càng ít càng tốt, vì lớp dung dịch này sẽ dàn trải một lớp mỏng trên cột.
Có thể áp dụng tính toán cụ thể như sau: thể tích dung môi cần lấy đê hoà tan mẫu = 0,4.d2ml, với d là đường kính trong của cột tính bằng mm.
M ầu được cho trực tiếp vào cột bằng ống hút mẫu (pipet). Cho mẫu chảy vào từ từ theo thành cột. Với phương pháp nạp mẫu này chúng ta cho dung môi trong cột chảy xuống sát bề mặt silicagel trong cột rồi khoá cột. Sau đó, m ở khoá để mẫu chảy xuống đến sát bề mặt silicagel. Cho từng lượng nhỏ dung môi chạy cột vào đế mẫu chảy qua bề mặt silicagel trong cột và rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột (đê lớp mẫu chất chảy xuống được đồng đều).
1.5. Tổng quan về các p h u ’O’n g pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu CO'
Cấu trúc của chất phân lập ra được xác định bằng sự kết hợp của nhiều phương pháp khác nhau. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất m à người ta sử dụng các phương pháp khác nhau, c ấ u trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp càng cao.
1.5.1.Điếm nóng chảy (Mp)
Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn vật lý rất quan trọng. Thông thường việc phân tích đầu tiên sau khi thu được một sản phẩm kết tinh là việc xác định điểm chảy vì đó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lượng rất ít mẫu thử.
Neu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau không quá 0,5°c thì có thê xem sản phẩm kết tinh là tinh khiết. Khi điêm chảy xác định được, đối chiếu với tài liệu tham khảo để có thể đưa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu.
1.5.2. Độ quay cực ([a]ũ)
Ánh sáng tự nhiên đi qua một môi trường bất đẳng hướng, trong điều kiện nhất định nào đó, do tác dụng của môi trường làm cho cường độ điện trường chỉ còn dao động theo m ột phương nhất định được gọi là ánh sáng phân cực thẳng hay ánh sáng phân cực toàn phần.
M ặt phang chứa tia sáng và phương dao động của vectơ điện trường được gọi là mặt phang dao động, còn mặt phang chứa tia sáng và vuông góc với mặt phang dao động gọi là mặt phang phân cực.
Khi cho ánh sáng phân cực thẳng đi qua dung dịch một chất quang hoạt thì mặt phẳng phân cực sẽ bị quay một góc a. Tuỳ theo chất quang hoạt mà góc quay này có thể sang phải (+) hay sang trái (-). Độ lớn của góc quay a phụ thuộc vào nồng độ c (g/lOOml dung dịch), chiều dài lớp dung dịch (dung môi) 1, nhiệt độ t và chiều dài sóng
X:
Cỉ
a = [ a ĩ ;
100
1.5.3. P h ổ cộng hư ởn g từ hạt nhân (Nuclear M agnetic Resonancespectroscopy,
N M R )
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay được dùng đê xác định cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ nói chung và hợp
và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của các phương pháp phổ N M R (phổ proton và phô carbon) là sự cộng hưởng ở các tần số khác nhau của các hạt nhân từ ('H và l3C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học. Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau.
> Phố - NM R: Trong phổ 'H - N M R , độ dịch chuyển hoá học (5) của các proton được xác định trong thang từ 0 đến 14 ppm tuỳ thuộc vào m ức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân từ. Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hoá học khác nhau. D ựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà người ta có thê xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
> Phổ Ì3C - N M R: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở m ột trường khác nhau và cho m ột tín hiệu phô khác nhau. Thang đo cho phổ l3C - N M R cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 đến 240 ppm).
> Phổ D E PT: Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khac nhau. Trên các phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc 4 biến mất. Tín hiệu phổ của CH và C H3 nằm về một phía và của C H2 thì nằm về phía đối diện trên phổ D EPT 1 35°. Còn trên phổ DEPT 90° thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
> Phổ 2D - NM R: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều.