2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:
- Bình chiết 30 lít.
- Máy cô quay chân không.
- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm và 368 nm. - Micropipet.
- Tủ sấy chân không.
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khỏa Luận Tốt Nghiệp
- Máy sấy, bếp điện
- Bình sắc ký loại phân tích và điều chế. - Cột sắc ký pha ngược trung áp.
- Cột sắc ký pha thường đường kính khác nhau. - Máy phun dung dịch thuốc thử.
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc
- Máy phổ cộng hưởng tù’ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer.
2.5. Hoá chất
- Silica gel 60 (0,04-0,063 mm) Merck.
- Silica gel pha đảo ODS hoặc YMS (30-50 \xm, Fujisilica Chemical Ltd). - Bản mỏng có tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715). - Bản mỏng tráng sẵn pha đảo RP18 F254s (Merck).
- Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
- Các loại dung môi hữu cơ như metanol, etanol, etyl axetat, cloroform, hexan, axeton... là loại hoá chất tinh khiết của Merck.
CHƯƠNG 3: THỤC NGHIỆM 3.1. Phân lập các họp chất
Mầu Hải miên Haliclona varỉa (5,8 kg) được làm sạch để loại bỏ muối natri clorua sau đó chiết bằng methanol (3x2 lít) kết hợp sử dụng thiết bị chiết siêu âm (50°c, 3h). Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gom lại và loại bỏ dung môi thu được (25,3 g) dịch chiết methanol. Cặn dịch này được hòa tan vào 1 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố với dichloromethane thu được cặn dịch tương ứng là 18,0 g và dịch nước.
Phần cặn dichloromethane (HV, 18,0 g) được hòa tan với một lượng tối thiểu dichloromethane sau đó tẩm với 45,0 g silica gel, cất quay cho đến khi bột tơi khô. Tiến hành phân tách hỗn họp này bằng cột silica gel pha thường, rửa giải gradient bằng hệ dung môi 72-hexane/acetone với độ phân cực tăng dần (n-hexane/acetone, 100/0—>0/1, v/v) thu được 5 phân đoạn HV1 (3,5 g), HV2 (2,3 g), HV3 (1,7 g), HV4 (4,5 g) và HV5 (3,1 g).
HV2 (2,3 g) được phân tách bằng cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp n-hexane/acetone (2,5/1, v/v) thu được 3 phân đoạn HV2A (0,8 g), HV2B (1,3 g) và HV2C (0,5 g). Phân đoạn HV2A tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hỗn họp metanol/nước (1,5/1, v/v) thu được hợp chất 1(14 mg).
Phân đoạn HV3 (1,7 g) sử dụng sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi rửa giải acetone/nước (2/1, v/v) thu được 2 phân đoạn HV3A (0,5 g) và HV3B (0,7 g). Tiếp tục phân tách HV3A (0,5 g) bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rủa giải bằng hỗn họp dichloromethane/acetone (6/1, v/v) thu được hợp chất 2 ( 1 0 mg).
Trường Đại Học Su' Phạm Hà Nội 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp
So’ đồ 3.1: Sơ đồ phân lập các họp chất từ Hải miên Halỉclona varia
3.2. Tính chất hóa lý của các họp chất phân lập được
3.3.1. Hợp chất 1
Tên khoa học: 3ị3-Hydroxycbolest-5-ene-7-one. Dạng bột vô định hình, màu trắng.
Công thức phân tử : C27H4402 (M= 400), 'H-NMR (500 MHz, CDCI3) và 13C-NMR ( 125 MHz, C D C I3), xem bảng 4.1.
3.3.2. Hợp chất 2
Tên khoa học: (22E)-3p-Hydroxycholesta-5,22-dien-7-one. Dạng bột vô định hình, màu trắng.
Công thức phân tử: C27H4202, (M= 398), 'H-NMR (500 MHz, CDC13) và l3C-NMR (125 MHz, CDCI3), xem bảng 4.2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khỏa Luận Tốt Nghiệp
CHƯƠNG 4: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của họp chất 1:3ị}-Hydroxycbolest-5-ene-7-one
Hình 4.1.a. Cấu trúc hóa học của họp chất 1
Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng bột, vô định hình, màu trắng. Phổ 'H- và l3C-NMR cho biết sự xuất hiện của 5 nhóm methyl trong đó có hai nhóm methyl đính với cacbon bậc ba tại ôc 11,96 (C-18)/ÔH 0,68 (s, H-18) và 17,3 (C-19)/ÔH 1,21 (s, H-19), ba nhóm methyl đính với cacbon bậc hai tại ôc 18,86 (C-21)/ÔH 0,92 (d, J = 6.5 Hz, H-21), 22,54 (C-26)/0,87 (d, J = 6,5 Hz, H-26), 22,79 (C-27)/0,87 (d, J = 6,5 Hz, H-27) và một nhóm oxymethine tại ôc 70,46 (C-3)/ôH 3,63 (m, H-3), tín hiệu một proton olefin tại Ôh 5,67 (s, H-6), cho phép dự đoán đây là một steroit; một dạng hợp chất phổ biến và đặc trưng có mặt trong các loài hải miên.
- “i -'i ^ ^ r s ÍSCS<N CN f \ ÍN cs «S CN fS ÍN CNíNCv ÍS ÍN ÍN « N « N rs r» (N fS t s r» r s r» - — — — — — — — — — — — — — — — — — — — L L L L L L L L L L L L ^ ^ r ^ ^ Ẻ i r r p Ì É É É É É t t t t n 1 1 I 1 J J J J j í 2 Ể ếm ầ1 <0№ w ìị 3C éCc - ;F r —- *•- —: p | ; ĩậ “ - *r *r - Hình 4.1.b. Phổ 'H- NMR của hợp chất 1 2 2 0 2 0 0 1 8 0 1 6 0 1 4 0 1 2 0 1 0 0 a o 6 0 4 0 2 0 0 p p m Hình 4.I.C. Phổ '3C -NMR cùa họp chất 1
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khỏa Luận Tốt Nghiệp
D E P T 9 0
I I ill 1.1 .
2.: 2.: lì: :i: :i: lì: 14: li: :i: li: ::: »: i: lí i: j: 4: i: i: ppn
2 i : j: : 1 » : l i : 162 u : 12Z I I I : : : » : i : D t : 5-: « : 5 : 2 : ppn
Hình 4.1.d. Phổ DEPT- NMR của họp chất 1
Ngoài ra, sự xuất hiện tín hiệu tại ôc 202,24 (C-7) gợi ý sự có mặt của nhóm cacbonyl. Vị trí của nhóm cacbonyl này được khẳng định bằng các tương tác HMBC giữa H-8 (ÔH 2,22) và H-9 (ÔH 1,52).
Các tương tác HMBC giữa H-26 (ỗH 0,87)/H-27 (ÔH 0,87) và C-24 (5c 39,47)/C-25 (ôc 27,98); H-18 (ÔH 0,68) và C-12 (5c 38,71)/C-13 (§c 41,82)/C- 14 (5c 49,95)/H-19 (ỗH 1,21) và C-l (5c 36,36)/C-5 (5c 165,23)/C-9 (Sc 49,97)/C-10 (Sc 38,38) cho phép xác định vị trí của hai nhóm methyl tại C-25 và hai nhóm methyl còn lại tại C-10 và C-13.
Các tương tác HMBC giữa H-6 (Sh 5,67) và C-4 (ỗc 43,10)/C-8 (5c 45,41)/c-10 (5c 38,38); giữa H-4 (ÔH2,42 và 2,52) và C-3 (ỗc 70,46)/C-5 (Sc 165,23)/C-6 (Sc 126,05) khẳng định vị trí của liên kết đôi tại C-5/C-6 và nhóm hydroxyl tại C-3.
Hình 4.1.e. Phổ HSQC của hợp chất 1
Hình 4.1.g. Phổ HMBC của họp chất 1
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khỏa Luận Tốt Nghiệp
So sánh với số liệu phổ NMR của họp chất 1 với số liệu phổ đã được công bố [5] cho thấy sự tương đồng về giá trị phổ giữa hai hợp chất. Điều này khẳng định hợp chất 1 là : 3p-Hydroxycbolest-5-ene-7-one.
Hình 4.1.h. Các tương tác HMBC của họp chất 1
Bảng 4.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1 và chất tham khảo. c X #Oc <>c? a.b ÔHa*c ( / = Hz) H ^ C 1 36,46 36,36 1,95 (m)/l,21 (m) 3,5 2 31,29 31,16 1,62 (m)/l,94 (m) 4, 10 3 70,61 70,46 3,63 (m) 4 41,90 43,10 2,42 (m)/2,52 (m) 2, 3 ,5 ,6 5 165,23 165,23 - 6 126,27 126,05 5,67 (s) 4, 8, 10 7 202,40 202,34 - 8 45,52 45,41 2,22 (m) 7 9 50,07 49,97 1,52 (m) 7, 11 10 38,38 38,38 - 11 21,34 21,21 1,58 (m) 9, 12, 13 12 38,82 38,71 1,14 (m)/2,02 (m) 17 13 41,90 41,82 - 14 50,07 49,95 1,52 (m) 16 15 26,41 26,31 1,25 (m)/2,41 (m) 13, 14, 17 16 28,60 28,52 1,28 (m)/l ,92 (m) 15 17 54,91 54,81 1,08 (m) 13, 16 18 12,07 11,96 0,68 (s) 13, 14, 15, 17 19 17,40 17,30 1,21 (s) 1 ,5 ,9 , 10 20 35,80 35,69 1,41 (m) 21 18,96 18,86 0,92 (d, 6,5) 17, 20, 22 22 36,28 36,18 1,01 (m) 23 23,92 23,82 1,12 (m)/l,33 (m) 24 39,58 39,47 1,12 (m) 25 28,09 27,98 1,52 (m) 26 22,64 22,54 0,87 (d, 6,5) 24, 25, 27 27 22,88 22,79 0,87 (d, 6,5) 24, 25, 26
"đotrong CDịOD ,b 125MHz. c500MHz. Sc^-Hydroxycholest-Sene-T-one,
trong CDCI3
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khỏa Luận Tốt Nghiệp
4.2. Xác định cấu trúc hoá học của hợp chất 2: (22E)-3p-Hydroxycholesta-5,22-dien-7-one.
Hình 4.2.a. Cấu trúc hóa học của họp chất họp chất 2
Hợp chất 2 được phân lập dưới dạng bột vô định hình, màu trắng.
Phổ 'H- và l3C-NMR cho biết sự xuất hiện của 5 nhóm methyl trong đó có hai nhóm methyl đính với cacbon bậc ba ôc 12,20 (C-18)/ÔH 0,68 (s, H-18) và 17,32 (C -19)/1,20 (s, H-19), ba nhóm methyl đính với cacbon bậc hai ôc 21,06 (C-21 ) / ỗ H 01,01 (d, J = 6,5 Hz, H -21), 22,30 (C-26)/0,88 (d, J = 6,5 Hz, H-26), 22,30 (C-27)/0,88 (d, J = 6,5 Hz, H-27) và một nhóm oxymethine ôc 70,46 (C -3)/8h 3,63 (m, H-3), tín hiệu ba proton olefin tại ỗH 5,79 (m, H-6), ÔH 5,25 (m, H-22), ÔH 5,28 (m, H-23), cho phép dự đoán đây là một steroit; một dạng hợp chất phổ biến và đặc trung có mặt trong các loài hải miên.
Hình 4.2.b. Phổ ‘H-NMR của họp chất 2 * : :! SịÍ5ỈỊ;SỊễỉỊ!ỉ5ỊÍỈỈSỈSỊ5Ị tc Ẩ Ẩ sè ã •T Ậ 3* — — 3* Ậ sệ lệ — X À >é «s <s — — ÍS — — — — • s ,N “* « . « * . ' ! " T ,T T ' y * T ^ ^ " ' ^ ^ p » c S P i í S c S c S í S - - 1 1V Hình 4.2.C. Phổ l3C-NMR cùa hợp chất 2
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khỏa Luận Tắt Nghiệp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
D E P T 9 0
I...r... I 1 1 ...I...I ...»...I... 1 I... . ' ' I ... I... 11 I I ...ì... ...!... ...
j : : ỉ : : l i : n : : e : : ỉ : : ỉ : : : : : : : >: i : 1 Z »: »: Ì Z »: 2: p p n
C 1 3 C P D
2 i : 2: : : i : n : ; e : 13: : a : : : : : : : »: I : -r: e: 5: <: ỉ : 2: ppn
Hình 4.2.d. Phổ DEPT của họp chất 2
Ngoài ra, sự xuất hiện tín hiệu tại ôc 202,20 (C-7) gợi ý sự có mặt của nhóm cacbonyl. Vị trí của nhóm cacbonyl này được khẳng định bằng các tương tác HMBC giữa H-8 (ÔH 2,23) và C-7 (Sc 202,20); giữa H-9 (SH 1,51) với C-7 (Sc 202,20)/C-8 (ỗc 45,40).
Các tương tác HMBC giữa H-26 (ỖH 0,88)/H-27 (ÔH 0,88) và C-24 (5c 41,95)/C-25 (5c 28,56); H-18 (ÔH 0,68) và C-12 (5c 38,60)/C-13 (ỗc 43,02)/C-
14 (5c 50,06)/C-17 (5c 54,68); H-19 (ÔH 1,20) và C-l (ỗc 36,37)/C-5 (ỗc
165,10)/C-9 (Ôc 49,97)/C-10 (ôc 38,29) cho phép xác định vị trí của hai nhóm methyl tại C-25 và hai nhóm methyl còn lại tại C-10 và C-13.
Các tương tác HMBC giữa H-6 (SH 5,79) và C-4 (Sc 41,83)/C-7 (ỗc
202,20)/C-8 (Sc 45,40); giữa H-4 (SH 1,82) và C-3 (ôc 70,52) khẳng định vị trí của liên kết đôi tại C-5/C-6 và nhóm hydroxyl tại C-3, các tương tác HMBC giữa H-22 ( S h 5,25) và C-20 (ôc 39,89)/C-21 (5c 21,06)/C-24 (5c 41,95); giữa
H-23 ( Ô H 5,28) và C-20 ( 5 C 39,89)/C-24 (5c 41,95) khẳng định vị trí của liên kết đôi tại C-22/C-23. V» Ln Hình 4.2 e. Phổ HSQC của họp chất 2 Hình 4.2.g. Phổ HMBC của hợp chất 2 S/«/ĩ Nguyễn Thị Ly 45 Lớp K37Ả - Hóa học
So sánh với số liệu phổ NMR của họp chất 2 với số liệu đã được công bố [4] cho thấy sự tương đồng về giá trị phổ giữa hai hợp chất. Điều này khẳng định hợp chất 2 là : (22E)-3p-Hydroxycholesta-5,22-dien-7-one.
Trường Đại Học Su' Phạm Hà Nội 2 Khóa Luận Tốt Nghiệp
Hình 4.2.h. Các tưong tác HMBC của họp chất 2
Bảng 4.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 2 và chất tham khảo c £ a.b ÔHa*c ( i = Hz) H ^ C 1 36,46 36,37 1,20 (m)/l ,95 (m) 2 31,29 31,20 1,62 (m)/l ,94 (m) 3 70,61 70,52 3,68 (m) 4 41,90 41,83 1,82 (m) 3 , 5 , 6 5 165,23 165,10 - 6 126,27 126,44 5,79 (m) 4, 8, 10 7 202,40 202,20 - 8 45,52 45,40 2,23 (m) 7, 9, 11 9 50,07 49,97 1,51 (m) 10 38,38 38,29 - 11 21,34 21,22 1,59 (m) 12 38,82 38,60 1,17 (m)/2,00 (m) 13 41,90 43,02 - 14 50,07 50,06 1,34 (m) 13, 16 15 26,41 26,35 1,24 (m)/2,39 (m) 16 28,60 28,75 1,28 (m )/l,78 (m) 17 54,91 54,68 1,14 (m) 18 12,07 1 2 , 2 0 0,68 (s) 12, 13, 14, 17 19 17,40 17,32 1,20 (s) 1,9, 10 20 35,80 39,89 2,05 (m) 17, 21, 22, 23 21 18,96 21,06 1,01 (d, 6,5) 17, 20, 22 22 36,28 137,88 5,25 (m) 20, 21, 24 23 23,92 126,11 5,28 (m) 20, 24 24 39,58 41,95 2,39 (m)/2,50 (m) 25 28,09 28,56 1,59 (m) 26 22,64 22,30 0,88 (d, 6,5) 24, 25, 27 27 2 2 , 8 8 22,30 0,88 (d, 6,5) 24, 25, 26
ađotrong CD3OD, ]25MHz.c500MHz. ÔC#,(22E)-3Ị3-H ydroxycholesta-5,22-
dien-7-one trong CDC13.
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khỏa Luận Tốt Nghiệp
KẾT LUẬN
Khoá luận tốt nghiệp với đề tài: “ Các họp chất steroit phân lập từ
loài Hải miên Haliclona varia” đã thu được kết quả sau:
1, Bằng phương pháp sắc ký nhồi cột chất hấp phụ silica gel pha thường và sắc ký lớp mỏng điều chế đã phân lập được hai họp chất steroit từ hải miên Halỉclona varia.
- Hợp chất 1: 3(3-Hydroxycbolest-5-ene-7-one.
- Hợp chất 2: (22E)-3p-Hydroxycholesta-5,22-dien-7-one.
2, Cấu trúc của các hợp chất này được xác định nhờ vào các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ('H-NMR, 13C- NMR, DEPT), phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HSQC, HMBC) và các dữ liệu phổ được công bố.
Họp chất 1:
3 P-Hydroxycbolest-5 -ene-7 -one
Họp chất 2: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(22E)-3p-H ydroxycholesta-5,22- dien-7-one.
HO
.26
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1]. Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Lê Mai Hương, Phạm Quốc Long, Hoàng Thanh Hương, Nguyễn Minh Hà, Đỗ Công Thung, Tống Kim Thuần, Nguyễn Huy Nam, Trương Hương Lan, Đặng Diễm Hồng, Đoàn Thái Hưng, (2009), Nghiên cứu sang lọc các chất có hoạt tính sinh học theo định hướng kháng sinh, gây độc tế bào và chong ôxi hóa từ sinh vật biến nhằm tạo các sản phấm có giá trị thực dụng.
[2]. Phan Văn Kiệm, Phạm Hải Yen, Hoàng Lê Tuấn Anh, Châu Văn Minh, Đan Thị Thúy Hằng, Nguyễn Thị Cúc, Dương Thị Hải Yến, Dương Thị Dung, (2012)," Các hợp chat sterol phân lập từ loài hải miên Halỉclona
subarmigera", Tạp chí hóa học, T. 50(3) 365-368.
Tài liệu Tiếng Anh
[3] Dictionary of Natural Products on DVD, version 18.1, Copyright® 1982- 2009 CRC Press.
[4] Francesco De Riccardis, Luigi Minale (1993), “Marine sterols. Side-chain-
oxygenated sterols, possibly of abiotic origin, from the new Caledonian sponge
stelodoryx chlorophylla” Journal o f Natural Products, Vol. 56(2), pp. 282-287. [5]. G. Notaro, V. Piccalliw, and D. Sica (1992), “New steroidal hydroxylketones and closely related diol from the marine sponge clzona copzosa”, Journal o f Natural Products, Vol.55(l 1), pp. 1588-1594.
[6]. Newman, D. J., Cragg, G. ML, and Snader, K. M., (2000) The influence of natural products upon drug discoveiy. Natural Product Reports, 17, 215-234.
[7] P. K. Agrawal (1992), “ NMR spectrosccopy in the structural elucidation of oligosaccharides and glycoside”, Phytochemistry, Vol.31, 3307 - 3330.