Trong phương pháp sắc ký: pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
* Theo bản chất của hai pha sử dụng
- Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn: thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có thể nạp nén vào trong một cột.
+ Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang.
- Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí
+ Pha động là chất lỏng: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột.
+ Pha động là chất khí: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký khí. Trong trường họp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vectơ.
* Theo bản chất của hiện tựợng xảy ra trong quá trình phân tách chất. - Sắc ký phân chia (partition chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)
+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng này được nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn.
- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography) + Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt 1'ắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.
- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography) + Pha động chỉ có thể là chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học là polymer nên gọi là hạt nhựa. Be mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học ở dạng ion. Có hai loại hạt nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation. - Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography), gel filtration chromatography)
+ Pha động chỉ có the là chất lỏng.
+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bang polymer, trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng.
- Sắc ký ái lực (aninicy chromatography)
+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein.
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khỏa Luận Tắt Nghiệp
+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị. Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở.
- Sắc ký lỏng cao áp
+ Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kế. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm tù’ vật liệu mịn hơn nên để có được một tốc độ chảy thích hợp, phải có một áp lực tác động lên cột. Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration).
- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper thin - layer chromatography). Trong sắc ký giấy:
+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos + Pha động: là chất lỏng
Trong sắc ký lớp mỏng:
+ Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel, là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực
+ Pha động: luôn luôn là chất lỏng
- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)
+ Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa.
+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ. Mau cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh
+ Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột
* Theo trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký lỏng và sắc ký khí.
* Theo cách tiến hành sắc ký, người ta chia sắc ký thành các nhóm nhỏ: sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng.
ỉ . 4.3.1. Sắc ký cột (C.C)
Sắc ký cột là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, đơn giản nhất. Chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chúng được nhồi vào cột (cột có thế bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại. Tuy nhiên, hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được) có thể xảy ra nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ, tốc độ chảy càng giảm. Khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn họp chất cụ thể.
Trong sắc ký, Rf được gọi là tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thế tách tùng chất ra khỏi hỗn hợp.
Tuỳ theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ chất so với chất hấp phụ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 - 1/10), tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30.
Trong sắc ký cột, tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất sẽ có các phương pháp khác nhau để có thể đưa chất lên c ộ t . Neu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khỏa Luận Tắt Nghiệp
lên cột. Neu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột: - Cách 1: Nhồi cột khô.
Chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt.
Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và cột không được nút, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Neu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc còn nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách.
1.4.3.2. Sắc ký lóp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh, thường được sử dụng để kiếm tra và định hướng cho sắc ký cột. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trục tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silica gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trung cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.
1.5. Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các họp chất hữu cơ [9]
Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể. cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối họp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các họp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, các phương pháp sắc ký so sánh...
1.5.1. Pho hằng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại.
Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Vì vậy, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất dựa vào phổ hồng ngoại, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300 - 3450 cm'1, của nhóm cacbonyl c = o trong khoảng 1700 - 1750 cm'1, của nhóm c = c trong vùng 1630 - 1650 cm'1, của nhóm ete c - o - c trong vùng 1020 - 1100 cm '1,... Đặc biệt vùng dưới 700 cm' 1 được gọi là vùng vân tay, được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hũu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp.
Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mà lượng chất cần để thực hiện phép đo này lại cần đến 2 - 3 mg chất và khó thu hồi lại. Vì vậy, đối với các họp chất thiên nhiên (lượng chất thu được ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác như phổ cộng hưởng từ hạt nhân hay phổ khối lượng.
/.5.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các họp
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khỏa Luận Tắt Nghiệp
chất vì phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:
- Phô EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV.
- Phô ESI-MS {Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện từ. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
- Phổ FAB-MS {Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là pho ban phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
- Phố khối lượng phân giải cao (High Resolution mass spectroscopy),
cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
- Hiện nay, người ta còn sử dụng kết họp các phương pháp sắc ký kết họp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc ký khí - khối phổ) cho các chất dễ bay hơi như tinh dầu hay LC-MS (sắc ký lỏng - khối phổ) cho các họp chất khác. Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược).
1.5.3. Phố cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Các nhà nghiên cún có thể xác định chính xác cấu trúc của họp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử với việc sử dụng kết họp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều.
Sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ ('H và l3C) dưới tác dụng của từ trường ngoài là nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon). Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
1.5.3.1. Phổ 'H-NMR
Trong phổ 'H-NMR, độ dịch chuyển hoá học (S) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14 ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trung riêng của từng phần. Người ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của họp chất dựa vào những đặc trung của độ dịch chuyển hoá học và tương tác spin.
1.5.3.2. Phổ '}C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ l3C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230 ppm.
1.5.3.3. Phô DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)
Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135°. Trên phổ DEPT 90° chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH.
1.5.3.4. Phổ 2D-NMR
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân từ trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phô HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)’. Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ,
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khỏa Luận Tắt Nghiệp
một trục là phổ 'H-NMR, còn trục kia là l3C-NMR. Các tương tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ 'H -'H c o s y (HOMOCOSY) ( H - ‘h Chemical Shif Correlation
Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các
proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
- Phố HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phố biểu diễn tương tác xa của H và c trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Các proton có cùng phía cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ với cường độ mạnh hơn bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định.
Ngoài ra, người ta còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơnghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể nên phạm vi sử dụng của phổ này hạn chế. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hũu cơ.
Ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp chuyến hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh, kết hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín