5. Điểm mới của đề tài
2.1.1. Nguyên liệu chính
Quả nho và dịch siro thu được từ quả nho.
Chủng nấm men nghiên cứu phân lập từ dịch siro quả nho có vị trí phân loại theo Yelinov N.P (1996) sau đây:
Lớp : Hemiascomycetes Bộ : Endomycetales Họ : Saccharomycetaceae Chi : Saccharomyces Loài : cerevisiae 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 2.1.2.1. H t
Hóa chất: MgSO4.7H20, K2HPO4, (NH4)2SO4, agar, pepton, các loại muối, các loại đường.
2.1.2.2. Dụn ụ và t ết bị
Dụng cụ: bình tam giác, ống nghiệm, hộp lồng, que trang, phễu thủy tinh, đèn cồn, que cấy….
Thiết bị: Tủ sấy, nồi hấp, buồng cấy vô trùng, cân phân tích, kính hiển vi, đường kế, cồn kế…
18
2.1.3. Các loại môi trường
2.1.3.1. Mô tr n H ns n (MT1) Hóa chất g/l Đường glucoza 50 Pepton 5 MgSO4.7H20 0,5 K2HPO4 1 (NH4)2SO4 1 Thạch Agar 20 Nước 1000ml 2.1.3.2. Mô tr n n ân ốn (MT2) Hóa chất g/l Đường glucoza 50 Pepton 5 MgSO4.7H20 0,5 K2HPO4 1 (NH4)2SO4 1 Nước 1000ml 2.1.3.3. Mô tr n n m n (MT3) Hóa chất g/l
Dịch siro hoa quả 200ml
MgSO4.7H20 0,5
K2HPO4 1
(NH4)2SO4 1
19
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
Để chọn một chủng nấm men ta sử dụng phương pháp phân lập trên hộp petri, sau đó tuyển chọn dựa trên việc nghiên cứu hình thái tế bào, xác định số lượng tế bào, hoạt lực lên men. Môi trường để tuyển chọn các khuẩn lạc nấm men là môi trường Hansen (MT1).
2.2.2. Phương pháp vật lí, hóa học
Xác định hàm lượng đường bằng đường kế.
Xác định độ cồn bằng ancol kế và phương pháp hóa học. Xác định độ pH bằng giấy đo pH.
Xác định hàm lượng acid trong dung dịch lên men bằng cách dựa vào nguyên tắc trung hòa acid bằng dung dịch NaOH 0,1N. Từ số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ ta suy ra được hàm lượng acid có trong dung dịch.
2.2.3. Phương pháp toán học
Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phương pháp như:
Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: 1 1 n i i X X n
Trung bình bình phương các sai lệch:
1 ) ( 1 2 n X X n i i
Sai số đại diện của trung bình cộng: M = S
20 Hệ số biến thiên: Cv = S X x 100% Trong đó: n: Số lần nhắc lại Xi: Giá trị của lần thứ i S: Độ lệch chuẩn m: Sai số trung bình học
2.3. Đối tƣợng nghiên cứu
Quả nho và chủng nấm men phân lập, tuyển chọn được từ dịch siro nho có khả năng lên men vang nho.
2.4. Địa điểm thực hiện đề tài
21
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn và xác định tên khoa học của chủng nấm men có khả năng lên men vang nho có khả năng lên men vang nho
Nấm men đóng vai trò quan trọng đối với toàn bộ quá trình sản xuất và chất lượng của vang. Vì vậy, nấm men được sử dụng lên men vang từ dịch siro nho phải đạt các yêu cầu sau [16].
Lên men được ở nồng độ đường và nồng độ acid cao. Có hiệu suất lên men cao.
Có khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm.
Tạo hương thơm đặc trưng và không có vị lạ, không sinh độc tố. Ổn định lâu dài trong sản xuất.
3.1.1. Phân lập chủng nấm men từ dịch nho
Để chọn được chủng nấm men đầu tiên ta sử dụng phương pháp phân lập trên hộp petri. Môi trường để tuyển chọn các khuẩn lạc nấm men là môi trường Hansen (MT1). Qua phương pháp phân lập trên hộp petri, tuyển chọn ra một tập hợp tế bào nấm men của cùng một nòi có kích thước, hình thái, khả năng lên men như nhau.
Cách tiến hành: Khử trùng môi trường phân lập và phân vào các hộp petri vô trùng để nguội. Pha loãng dich nho bằng nước cất từ 10-1
- 10-10. Dùng pipet nhỏ một giọt dich huyền phù với độ pha loãng từ 10-1 đến 10-10 lên bề mặt thạch vào từng hộp petri, dàn đều bằng que trang, ghi rõ nồng độ pha loãng lên hộp petri. Gói kín và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 300C trong 2 - 3 ngày [14], trên bề mặt thạch thấy xuất hiện các khuẩn lạc với các đặc điểm: hình tròn, màu trắng, nhẵn bóng đặc trưng cho nấm men. Từ các hộp lồng này chúng tôi lựa chọn lấy các khuẩn lạc to, trơn, nhẵn, bóng, sáng đem cấy riêng
22
rẽ vào các ống thạch nghiêng, nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng tuyển chọn. Bằng cách tuyển chọn như trên lặp lại ba lần, thu được 20 chủng nấm men. Từ số mẫu này chúng tôi chọn được 3 chủng có đường kính khuẩn lạc lớn hơn 1,5mm. Chúng tôi dùng 3 chủng này làm đối tượng nghiên cứu, kí hiệu là N1, N2 và N3.
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho
3.1.2.1. Qu n sát ìn dạn tế bào tr n k n ển v qu n ọ
Để tiến hành quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học chúng tôi tiến hành phương pháp nhuộm kép 3 mẫu nấm men N1, N2 và N3.
Kết quả quan sát ta thấy, tế bào nấm men có hình ovan hoặc hình trứng. Trong đó mẫu N1 có kích thước tế bào lớn nhất.
Hình 3.1. Mẫu hình dạng tế bào của chủng nấm men N1 quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần
3.1.2.2. Xá ịn oạt n m n mẫu n m m n N1, N2, N3 bằn p ơn p áp ân trọn n bìn
Cách tiến hành: Các mẫu nấm men N1, N2 và N3 được lên men ở môi trường lên men (MT3) trong các bình lên men có dung tích 100ml với hàm lượng đường ban đầu là 250g/l, hàm lượng men giống ban đầu 10%, pH: 4, nhiệt độ 26 - 280C. Sau 48h, đem cân trọng lượng bình ban đầu sau đó mở
23
nắp bình lên men, tiếp tục đem cân trọng lượng bình thấy trọng lượng bình giảm đi. Đó chính là lượng CO2 sinh ra trong quá trình lên men. Lượng CO2
sinh ra càng nhiều thì trọng lượng bình càng giảm, chứng tỏ hoạt lực lên men càng cao. Kết quả thu được ở bảng sau:
Bảng 3.1. Hoạt lực lên men của các chủng nấm nem sau 48h
Chủng nấm nem N1 N2 N3
Lượng CO2 (g) 2,10 ± 0,2 1,85 ± 0,2 1,90 ± 0,2
Qua bảng 3.1 ta thấy chủng N1 có lượng CO2 thoát ra nhiều hơn chủng N2 và N3, chứng tỏ chủng N1 có hoạt lực lên men mạnh nhất.
3.1.2.3. K ả năn n m n n
Các chủng nấm men được cấy vào môi trường dịch nho và bổ sung đường với hàm lượng đường 250g/l, pH: 4, nhiệt độ 26 - 280
C, số lượng giống ban đầu 3,5×106 TB/ml. Xác định các chỉ tiêu cần thiết thu được kết quả ở bảng 3.2
Bảng 3.2. Khả năng lên men của các chủng nấm men trên môi trường lên men
Chỉ tiêu đánh giá Chủng nấm men
N1 N2 N3
Đường tổng số (g/l) 250 ± 0,2 250 ± 0,2 250 ± 0,2 HL đường sót (g/l) 3,4 ± 0,2 5,35 ± 0,2 4,86 ± 0,2 HL cồn (%V) 11,20 ± 0,2 9,90 ± 0,2 10,40 ± 0,2
HS lên men (%) 87,10 76,20 82,30
Qua bảng 3.2, chúng tôi nhận thấy chủng nấm men N1 có hàm lượng đường sót thấp nhất, hàm lượng cồn và hiệu suất lên men cao nhất sau đó đến chủng N3 và N2.
24
3.1.2.4. K ả năn n m n ở á ộ pH k á n u
Để xác định khả năng lên men của các chủng lên men ở các độ pH khác nhau, chúng tôi tiến hành lên men trong các bình tam giác 100ml, với hàm lượng 250g/l, pH: 4, nhiệt độ 26 - 280
C, số lượng giống ban đầu là 3,5×106 TB/ml. Với các độ pH: 3; 3,5; 4; 4,5; 5. Xác định lượng CO2 thoát ra sau 48h, kết quả ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau
STT Chủng Độ pH
3 3,5 4 4,5 5
1 N1 ++ +++ ++++ ++++ ++++
2 N2 + + +++ ++ ++
3 N3 + ++ ++++ ++++ +++
Trong đó: ++++: Hàm lượng CO2 được tạo ra > 32 g/l dịch lên men +++: Hàm lượng CO2 được tạo ra từ 16 ÷ 24 g/l dịch lên men ++: Hàm lượng CO2 được tạo ra từ 8 ÷ 16 g/l dịch lên men +: Hàm lượng CO2 được tạo ra < 8 g/l dịch lên men
Từ kết quả thu được cho thấy rằng: các chủng đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong khoảng pH từ 4 - 4,5. Chủng có hoạt lực lên men mạnh nhất là N1 tiếp sau là N3 và N2.
3.1.2.5. K ả năn kết ắn
Hòa sinh khối nấm men thu được vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút thời gian 3 - 5 phút và để lắng 15 phút. Chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khả năng kết lắng của ba chủng nấm men
Tên chủng N1 N2 N3
25
Theo kết quả ở bảng trên, chúng tôi nhận thấy chủng có khả năng kết lắng tốt nhất là N1, tiếp theo là các chủng N3 và N2.
3.1.2.6. K ả năn tạo ơn t ơm và ộ tron sản p ẩm
Sau khi kết thúc lên men được 30 ngày, chúng tôi tiến hành xác định khả năng tạo hương thơm bằng phương pháp cảm quan và xác định độ trong sản phẩm ở OD 600 ml. Chúng tôi thu được kết quả dẫn ra ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm
STT Chỉ tiêu đánh giá Chủng
N1 N2 N3
1 Độ đục (OD) 0,032 0,12 0,08
2 Hương thơm Thơm Ít thơm Thơm
Qua bảng 3.5, chúng tôi nhận thấy chủng N1 có độ đục thấp nhất và có hương thơm đặc trưng của vang nho, còn chủng N2 có độ đục cao nhất và cho hương thơm ít đặc trưng của vang nho. Qua đó chúng tôi quyết định giữ chủng N1 để tiếp tục nghiên cứu.
Tổng h p kết quả nghiên cứu trên chúng tôi nhận th y ch ng N1 có khả năn n m n tốt nh t, tạo sản phẩm có nhiều u ểm phù h p với các chỉ t u ề ra, vì vậy chúng tôi quyết ịnh chọn ch ng N1 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2.7. Xá ịn t n k o ọ mẫu N1
Căn cứ vào khóa phân loại của Lodder (1972), và các kết quả thí nghiệm đối với chủng nấm men N1 có đặc tính:
26
Hình 3.2. Khuẩn lạc của chủng nấm men N1
Hình 3.3. Chủng nấm men N1 trên môi trường thạch nghiêng
Sinh sản nảy chồi nhiều phía.
Tế bào hình trứng, hình ovan, hình cầu (hình 3.1).
Có khả năng lên men các loại đường như saccaroza, glucoza… đặc biệt lên men cho hiệu suất cao nhất là đường glucoza.
Điều kiện không thuận lợi hình thành 1 - 4 bào tử.
Từ đó chúng tôi xác định được tên khoa học của chủng nấm nem N1 phân lập từ dịch nho là Saccharomyces cerevisiae N1 (S. cerevisiae N1).
27
3.2. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng S. cerevisiae N1 trong quá trình nhân giống trình nhân giống
Trong quá trình sản xuất rượu vang, giai đoạn nhân giống chiếm một thời gian ngắn 24 - 28h nhưng lại có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tăng nhanh số lượng tế bào nấm men. Việc nghiên cứu động thái sinh trưởng, phát triển của chủng S. cerevisiae N1 là một phần trong quá trình sản xuất
rượu vang.
Để xác định động thái phát triển của chủng nấm men S. cerevisiae N1, tiến hành cấy giống vào môi trường nhân giống với số lượng tế bào ban đầu là 3,2 x 106 tế bào/ml, nuôi trên máy lắc 150 vòng/phút ở 300C. Sau 6h lại kiểm tra số lượng tế bào 1 lần. Kết quả thu được ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Khả năng sinh trưởng, phát triển của chủng S. cerevisiae N1 trong môi trường nhân giống
TG (Giờ) SLTB x 10 6 TB/ML 0 3,2 ±1,1 6 6,5 ±1,1 12 36 ± 1,1 18 102 ±1,1 24 175 ±1,1 30 17 8±1,1 36 152 ±1,1 42 72 ±1,1 48 55 ± 1,1
28 SLTB×106TB/ml 3.2 6.5 36 102 175 178 152 72 55 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0h 6h 12h 18h 24h 30h 36h 42h 48h TG (h) SLTB
Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn động thái phát triển của chủng nấm men S. cerevisiae N1 trong môi trường nhân giống
Qua hình 3.4 ta thấy, số lượng tế bào trong 6h đầu tăng chậm. Lượng tế bào tăng nhanh từ 12h đến 24h. Từ 24h đến 30h số lượng tế bào tăng chậm, ổn định và đạt giá trị cực đại. Từ 36h đến 48h số lượng tế bào bắt đầu giảm. Sở dĩ trong 6h đầu số lượng tế bào tăng chậm là do đây là thời gian nấm men làm quen với môi trường. Từ 6h đến 24h, nấm men thực hiện quá trình trao đổi chất để sinh trưởng nên số lượng tế bào tăng nhanh. Khi nguồn dinh dưỡng giảm thì số lượng tế bào có tăng nhưng không đáng kể, không có nguồn dinh dưỡng để sinh trưởng và sinh sản nên bị chết dần, đó là thời điểm 30h - 48h. Như vậy, quá trình sinh trưởng của chủng S. cerevisiae N1 có thể chia thành 4 giai đoạn:
Giai đoạn từ 0h - 6h ứng với pha tiềm phát. Giai đoạn từ 6h - 24h ứng với pha logarit Giai đoạn từ 24h - 30h ứng với pha cân bằng. Giai đoạn từ 30h - 48h ứng với pha suy vong.
29
Mục đích của thí nghiệm này là để xác định thời gian nhân giống thích hợp và là cơ sở để nghiên cứu ảnh hưởng của một số nhân tố tới quá trình phát triển của chủng nấm men đã tuyển chọn S. cerevisiae N1. Kết quả của tôi khi nghiên cứu về thời gian nhân giống đối với chủng S. cerevisiae N1 phù
hợp với một số tác giả [7], [8].
Từ kết quả trên tô xá ịnh th i gian nhân giống thích h p nh t c a ch ng S. cerevisiae N1 là 24h.
3.3. Nghiên cứu động thái quá trình lên men vang nho của chủng S. cerevisiae N1
Để xác định động thái lên men vang nho chúng tôi tiến hành lên men trong các bình có dung tích 500ml. Môi trường lên men là dịch siro nho được pha loãng với nước cất để đạt hàm lượng đường ban đầu là 250g/l, hàm lượng men giống là 10% giống, pH: 4, nhiệt độ là 26 - 280C. Tiến hành phân tích mẫu 2 ngày 1 lần trong 8 ngày liên tục. Kết quả thu được ở bảng sau:
Bảng 3.7. Sự biến đổi hàm lượng đường và cồn trong quá trình lên men vang nho
Thời gian (ngày) HL đường sót (%) HL cồn (%V)
0 25 ± 0,2 0
2 18,3 ± 0,2 3,4 ± 0,2
4 11,4 ± 0,2 7,5 ± 0,2
6 6,7 ± 0,2 9,2 ± 0,2
30 25 0 18.2 3.4 11.4 7.5 6.79.2 3.4 11.2 0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 8 Ngày HL đường sót (%) HL cồn (%V)
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn sự biến đổi hàm lượng đường và cồn sau 8 ngày lên men
3.2 150 299 310 300 245 215 160 0 50 100 150 200 250 300 350 0 2 4 6 8 10 12 14 Ngày SLTB
Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn động thái lên men vang nho của chủng S. cerevisiae N1
Qua hình 3.6 ta nhận thấy chủng S. cerevisiae N1 sinh sản và phát triển nhanh nhất ở 2 - 5 ngày đầu (pha sinh trưởng), duy trì ổn định ở ngày thứ 6 - 7 - 8 (pha cân bằng). Sau đó giảm dần vào các ngày sau do hàm lượng đường
31
giảm mạnh, hàm lượng cồn tăng dần. Đó là do phần lớn đường được chuyển hóa thành rượu dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm men.
Hàm lượng acid tổng số cũng tăng dần nhưng không lớn lắm do trong quá trình lên men rượu, ngoài việc tạo ra sản phẩm chính là rượu thì còn tạo nên các acid hữu cơ như acid axetic, lactic, xucxinic… Sự tạo thành acid trong quá trình lên men đã làm giảm độ pH của dịch lên men. Kết quả nghiên cứu về động thái lên men vang nho đối với chủng S. cerevisiae N1 của tôi phù hợp với một số tác giả [15].
Ch ng S. cerevisiae N1 sinh sản và phát triển nhanh nh t ở 2 - 5 ngày