3. Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn
2.5. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện ở điều kiện nhân tạo. - Ánh sáng: cƣờng độ chiếu sáng 3000 lux.
- Quang chu kì: 16 giờ/ngày. - Nhiệt độ: 240C – 260C.
- Độ ẩm trung bình: 60% - 70%.
2.6.Phƣơng pháp nghiên cứu
2.6.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Theo La việt Hồng & cộng sự, 2014 [3]:
* Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu in vitro
Mẫu các giống cúc đƣợc trồng và chăm sóc trong chậu đất ở trong phòng thí nghiệm.Khi cây có chồi non từ 3-4cm thì chúng ta tiến hành cắt đỉnh sinh trƣởng.Sau đó ta cắt các đốt thân chứa đỉnh sinh trƣởng và xử lý sơ bộ bằng cách:rửa xà phòng dƣới vòi nƣớc chảy,rồi rửa lại bằng nƣớc cất khử trùng trong buồng cấy vô trùng.
Lắc mẫu trong etanol 70% (v/v)/2 phút.Tiếp đến,rửa lại bằng nƣớc cất 3-4 lần.
Mẫu cúc đã khử trùng sơ bộ đƣợc tiến hành khử trùng bằng javen 5%/15 phút.
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên,với 3 lần nhắc lại,mỗi lần nhắc lại 15 bình,mỗi bình 2 mẫu
22 Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: +Tỉ lệ mẫu bị nhiễm khuẩn,nấm(%)
+Tỉ lệ mẫu sống vô trùng(%)
+Tỉ lệ mẫu vô trùng nhƣng chết(%)
Các thí nghiệm làm tƣơng tự lần lƣợt với các giống hoa cúc chất lƣợng cao nhằm tìm ra công thức tối ƣu để tạo vật liệu khởi đầu cho từng giống cúc.
* Thí nghiệm 2: Tái sinh chồi các giống cúc in vitro
Môi trƣờng thích hợp nhất cho quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi cúc là môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung 30 g/l saccharose+ 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP.
Sau 7 ngày theo dõi nếu mẫu sạch ta tiến hành cấy chuyển mẫu sang môi trƣờng : MS+ 30 g/l saccharose+ 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP+ 100 ml/l ND.
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. Sau 4 tuần theo dõi, ta tiến hành đánh giá các chỉ tiêu :
- Chiều cao chồi (cm). - Số lá hình thành/chồi. - Số chồi trên một mẫu.
2.6.2. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu đƣợc xử lý thống kê trên chƣơng trình Excel 2007 [5], [6]. Số mẫu sống không bị nhiễm khuẩn, nấm
Tổng số mẫu cấy
x 100 =
Số mẫu bị nhiễm khuẩn, nấm Tổng số mẫu cấy x 100 = Số mẫu vô trùng nhƣng chết Tổng số mẫu cấy x 100 =
23
CHƢƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1.Tạo vật liệu in vitro
Có thể nói trong các giai đoạn của kỹ thuật nhân giống in vitro thì giai đoạn tạo vật liệu in vitro đóng vai trò hết sức quan trọng, nó quyết định đến sự thành công của công trình nghiên cứu.
Nguồn mẫu ngoài tự nhiên khi đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao,… Các cây cúc khi đƣợc chăm sóc trong phòng thí nghiệm, khi ra chồi non ta tiến hành cắt và khử trùng theo công thức: xử lý sơ bộ + javen 5% (v/v)/15 phút thì ta thu đƣợc kết quả đƣợc trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.1. Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trƣởng của một số giống cúc Giống Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Mẫu sạch Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Trắng tuyết 37,5 62,5 0,0 Pha lê 55,6 44,4 0,0 Mai vàng 0,0 83,3 16,7 Pháo hoa 11,1 77,8 11,1 Lan tím 13,4 58,4 28,2 Phan vàng 9,7 90,3 0,0 Phan trắng 15,3 84,7 0,0 Tím huế 6,4 57,7 35,9 Sao đỏ 23,8 60,0 16,2 Chi xanh 18,0 74,2 7,8
24
Hình 3.1. Tỷ lệ mẫu sống - sạch trên đỉnh sinh trƣởng của một số giống cúc
Qua bảng số liệu và biểu đồ trên ta thấy khi sử dụng chất khử trùng là Javen đối với mẫu đỉnh sinh trƣởng của một số giống cúc thì chúng có hiệu quả tƣơng đối cao. Tuy nhiên, mỗi giống cúc lại có nhiều đặc điểm khác nhau về sinh lý, khả năng chống chịu,...vì thế mà hiệu quả khử trùng không đồng đều ở các giống cúc này. Cụ thể, với chất khử trùng là Javen có hiệu quả cao nhất đối với giống cúc Phan vàng (với hiệu quả khử trùng lên tới 90,3%), thứ hai là giống cúc Phan trắng (84,7 %). Có một số giống cúc thì khi khử trùng mẫu với công thức: xử lý sơ bộ + javen 5% (v/v)/15 phút thì tỉ lệ mẫu nhiễm rất thấp, tuy nhiên có thể do khả năng chống chịu với javen của mô kém nên dẫn đến mẫu chết.Ví dụ: Giống cúc Mai vàng có tỷ lệ mẫu nhiễm 0,0% tuy nhiên tỷ lệ mẫu chết lại lên tới 16,7%, hay Tím huế chỉ có 6,4% mẫu nhiễm nhƣng tỷ lệ mẫu chết lại chiếm 35.9%.
Với cùng một công thức khử trùng này, hiệu quả khử trùng thấp nhất với các giống: Pha lê (44,4%), Tím huế (57,7%).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1. Trắng tuyết 2. Pha lê 3. Mai vàng 4. Pháo hoa 5. Lan tím 6. Phan vàng 7. Phan trắng 8. Tím huế 9. Sao đỏ 10. Chi xanh 62.5 44.4 83.3 77.8 58.4 90.3 84.7 57.7 60 74.2 Hiệu quả khử trùng Hiệu quả khử trùng % Giống
25
Sau đây là một số kết quả sau 7 ngày theo dõi:
Hình 3.2. Hình ảnh mẫu bị nhiễm khuẩn
Hình 3.3. Hình ảnh mẫu sạch nhƣng chết
Hình 3.4. Hình ảnh mẫu sống – sạch
3.2. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trƣởng của một số giống cúc
Các mẫu cúc sạch thu đƣợc trong thí nghiệm tạo vật liệu in vitro sẽ đƣợc chuyển sang môi trƣờng MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND.
26
3.2.1. Chiều cao chồi
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của BAP đến chiều cao chồi của một số giống cúc
Giống Chiều cao chồi
Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4
1. Trắngtuyết 1,07 ± 0,10 1,45 ±0,02 2,53 ± 0,17 3,13 ± 0,89 2. Pha lê 1,02 ± 0,01 1,48 ± 0,03 2,10 ± 0,02 2,58 ± 0,01 3. Mai vàng 1,12 ± 0,04 2,01 ± 1,17 4,20± 0,25 5,50 ± 0,17 4. Pháo hoa 2,10± 0,03 2,73 ± 0,03 3,08 ± 0,05 3,80 ± 0,03 5. Lan tím 1,63 ± 0,01 2,01 ± 0,03 2,38 ± 0,02 2,73 ± 0,05 6. Phan vàng 1,23 ± 0,03 3,38 ± 0,11 5,38 ± 0,32 6,13 ± 0,02 7. Phan trắng 1,53 ± 0,03 1,85 ± 0,02 2,38 ± 0,01 3,00 ± 0,03 8. Tím huế 1,45 ± 0,07 2,18 ± 0,15 3,02 ± 0,06 4,10± 0,01 9. Sao đỏ 1,05 ± 0,02 2,05 ± 0,04 3,15 ± 0,04 3,40± 0,03 Chi xanh 1,05 ± 0,01 1,28 ± 0,01 1,53 ± 0,02 1,73 ± 0,05
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của BAP đến chiều cao chồi của một số giống cúc 0 1 2 3 4 5 6 7 Trắng
tuyết Pha lê vàngMai
pháo hoa
Lan tím Phan vàng
Phan
trắng Tím huế Sao đỏ Chi xanh
Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 cm Giống
27
Từ kết quả trên ta thấy, môi trƣờng MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND là môi trƣờng thích hợp cho sự sinh trƣởng của cây hoa cúc nói chung. Tuy nhiên, với mỗi loại giống cúc khác nhau thì sự sinh trƣởng lại không giống nhau.
Từ biểu đồ, ta có thể dễ dàng nhận ra, trong 4 tuần thì giống cúc Phan vàng có sự tăng trƣởng chiều cao mạnh nhất (với tuần 1 là 1,23cm và đến tuần 4 là 6,13cm).
Hình 3.6. Sự sinh trƣởng của giống cúc Phan vàng qua 4 tuần
Xếp ở vị trí thứ 2 là giống Mai vàng ở tuần 1 với chiều cao 1,12cm, tuần 2 tăng lên 2,1cm, tiếp đó nó có sự tăng trƣởng mạnh vào tuần 3 (4,2 cm) và tuần 4 (5.5cm).
T1 T2
28
Hình 3.7. Sự sinh trƣởng của giống cúc Mai vàng qua 4 tuần
Ngoài ra, giống Lan tím và Pháo hoa có tuần 1 phát triển rất mạnh (pháo hoa(2,1cm) và lan tím (1,63cm)) nhƣng đến 3 tuần tiếp theo thì tăng khá chậm.
Trong 10 giống nghiên cứu, chúng tôi thấy giống cúc Chi xanh là có sự tăng trƣởng về chiều cao kém nhất ( tuần 1 là 1,05cm → tuần 2 là 1,28cm → tuần 3 là 1,53cm → tuần 4 là 1,73cm)
T1 T2
29
Hình 3.8. Sự sinh trƣởng của giống cúc Chi xanh qua 4 tuần
T1
T4 T2
30
3.2.2. Hệ số nhân nhanh
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi của một số giống cúc
Giống Tổng số chồi T1 T2 T3 T4 1. Trắng tuyết 1,25 ± 0,25 2,50 ± 0,33 2,75 ± 0,92 4,00 ± 3,33 2. Pha lê 1,50 ± 0,33 2,75 ± 0,25 4,50 ± 1,00 5,50 ± 0,33 3. Mai vàng 1,25 ± 0,25 4,25 ± 0,92 10,75 ± 0,92 12,50 ± 1,67 4. Pháo hoa 1,50± 0,33 2,75 ± 0,25 9,50 ± 1,67 16,50 ± 1,67 5. Lan tím 2,25 ± 0,91 3,50 ± 1,00 3,75 ± 0,92 4,00 ± 0,67 6. Phan vàng 2,00 ± 0,67 4,25 ± 0,92 4,75 ± 0,25 5,25 ± 0,25 7. Phan trắng 1,25 ± 0,25 3,25 ± 0,92 6,50± 0,10 7,00± 0,67 8. Tím huế 2,75 ± 0,25 5,00± 0,67 5,25 ± 0,67 6,25 ± 0,25 9. Sao đỏ 2,25 ± 0,92 4,25 ± 0,92 6,00± 0,67 7,50 ± 1,00 10. Chi xanh 2,75 ± 0,25 6,50 ± 1,67 7,00 ± 0,67 7,75 ± 0,92
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi của một số giống cúc 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Trắng
tuyết Pha lê vàngMai
pháo hoa Lan tím Phan vàng Phan
trắng Tím huế Sao đỏ xanhChi
Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Hệ số nhân Giống
31
Nhƣ vậy, khi xét về ảnh hƣởng của môi trƣờng MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l
BAP + 100 ml/l ND đến hệ số nhân chồi của một số giống cúc thì thấy rằng với hai giống cúc Mai vàng (Hình 3.7), Pháo hoa là có hiệu quả vƣợt trội. Sau 4 tuần hệ số nhân chồi trung bình của Pháo hoa là 16,5, Mai vàng là 12,5.
Hình 3.10. Sự sinh trƣởng của giống cúc Pháo hoa qua 4 tuần
Một số giống cũng có hệ số nhân chồi khá cao sau 4 tuần: Chi xanh (7,75 chồi), Sao đỏ (7,5 chồi), Phan trắng (7,00 chồi).
T1 T2
32
Hình 3.11. Sự sinh trƣởng của giống cúc Phan trắng qua 4 tuần
Giống Phan vàng (Hình 3.6) thì có sự sinh trƣởng mạnh về hệ số nhân chồi ở 2 tuần đầu (tuần 1 là 2,25 chồi, tuần 2 là 4,25 chồi) nhƣng đến 2 tuần tiếp theo thì tổng số chồi tăng rất chậmvà sau 4 tuần là 5,25 chồi.
Với giống Lan tím (Hình 3.13) thì ở tuần 1 có hệ số nhân chồi khá tốt là 2,25 chồi, tuy nhiên liên tiếp trong 3 tuần tiếp theo thì hệ số nhân chồi tăng chậm. Sau 4 tuần Lan tím, Trắng tuyết là giống có hệ số nhân chồi thấp nhất (4,00 chồi). Tuy các giống này có hệ số nhân là 4,00 chồi thấp hơn các giống khác, song hệ số này so với các loài khác vẫn là tƣơng đối cao.Qua phân tích trên, ta có thể khẳng định môi trƣờng trƣờng MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND có tác dụng kích thích hệ số nhân chồi của các giống cúc nói chung, và ảnh hƣởng tối ƣu nhất cho giống cúc Mai vàng và Pháo hoa.
T1
T4 T2
33
3.2.3. Số lá/chồi
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của BAP đến tổng số lá/chồi của một số giống cúc Giống Số lá/chồi T1 T2 T3 T4 Trắng tuyết 1,60 4,00 7,27 6,75 Pha lê 2,67 2,91 4,80 5,45 Mai vàng 2,40 3,29 3,16 5,20 Pháo hoa 8,00 7,27 3,89 4,12 Lan tím 7,30 5,71 6,13 6,50 Phan vàng 5,00 4,23 5,68 6,09 Phan trắng 4,00 3,69 3,84 4,28 Tím huế 6,54 5,80 7,24 7,36 Sao đỏ 3,56 7,77 8,00 6,93 Chi xanh 3,64 5,15 4,57 5,16
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của BAP đến số lá/chồi của một số giống cúc
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Trắng
tuyết Pha lê vàngMai
pháo hoa
Lan tím Phan vàng
Phan
trắng Tím huế Sao đỏ Chi xanh
Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4
34
Với chỉ tiêu là số lá trên một chồi, ta thấy môi trƣờng nuôi cấy MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l NDcó ảnh hƣởng tốt đến sự sinh trƣởng của lá trên các chồi. Tuy nhiên, sự sinh trƣởng này không đồng đều ở các giống. Nếu nhƣ, giống Pháo hoa (Hình 3.10) phát triển mạnh về hệ số nhân chồi và chiều cao chồi thì đến chỉ tiêu thứ ba này lại khá là thấp sau 4 tuần theo dõi. Có thể là do ƣu thế đỉnh, cụ thể là: ở tuần đầu khi số chồi còn ít thì số lá trung bình trên chồi rất cao 8 lá/chồi → tuần 2 là 7,27 lá/chồi → tuần 3 là 3,89 lá/chồi → tuần 4 là 4,12 lá/chồi.
Bên cạnh đó, giống Lan tím cũng có số lá trung bình trên mẫu giảm khi số chồi tăng.
Hình 3.13. Sự sinh trƣởng của giống cúc Lan tím qua 4 tuần
T1 T2
35
Còn các giống còn lại hầu nhƣ có số lá trung bình trên chồi tỷ lệ thuận viêc tăng số chồi. Có 2 giống có số lá tăng mạnh nhất là Tím huế, Sao đỏ. Với giống Tím huế có số lá trên một chồi qua từng tuần là: 6,54 → 5,8 →7,24→ 7,36 (lá/chồi), còn giống Sao đỏlà 3,56→ 7,77 → 8 → 6,93 (lá/chồi).
Hình 3.14. Sự sinh trƣởng của giống cúc Tím huế qua 4 tuần
T1 T2
36
Hình 3.15. Sự sinh trƣởng của giống cúc Sao đỏ qua 4 tuần
Ngoài ra, các giống có sự tăng trƣởng về số lƣợng lácũng tƣơng đối cao là: Trắng tuyết (6,75 lá/chồi lá sau 4 tuần), Pha lê (6,5 lá/chồi sau 4 tuần).
T1 T2
37
Hình 3.16. Sự sinh trƣởng của giống cúc Trắng tuyết qua 4 tuần
T1 T2
38
Hình 3.17. Sự sinh trƣởng của giống cúc Pha lê qua 4 tuần
T2
T4 T3
39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Từ những kết quả thu đƣợc từ đề tài này, chúng tôi đƣa ra một số kết luận sau:
Thứ nhất, sử dụng chất khử trùng là javen với nồng độ 5%/15 phút có hiệu quả tƣơng đối cao đối với một số giống cúc. Trong đó, hiệu quả cao nhất ở giống cúc Phan vàng (với tỉ lệ mẫu sống vô trùng 90,3%).
Thứ hai, môi trƣờng MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND thích hợp cho sự sinh trƣởng của một số giống cúc về ba chỉ tiêu sinh trƣởng theo dõi: Chiều cao chồi, hệ số nhân nhanh, tổng số lá. Cụ thể:
Về chiều cao chồi, môi trƣờng MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND có tác dụng kéo dài chồi tƣơng đối tốt. Hai giống có chiều cao chồi trung bình cao nhất cúc Phan vàng (chiều cao trung bình 6,13cm),giống Mai vàng (5,50cm).
Về hệ số nhân nhanh, hệ số nhân khá cao ở các giống cúc nghiên cứu khi sử dụng môi trƣờngMS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND. Song giống cúc Mai vàng, Pháo hoa là có hiệu quả vƣợt trội. Sau 4 tuần hệ số nhân chồi trung bình của Pháo hoa là 16,50, Mai vàng là 12,50.
Về số lá/chồi, môi trƣờngMS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND kích thích sự phát triển lá trên các mẫu nuôi cấy. trong 10 giống thì hai giống có số lá trên một chồi sau 4 tuần là cao nhất là Tím huế(7,36 lá/ chồi) và Sao đỏ (6,93 lá/ chồi).
Khi kết hợp các chỉ tiêu theo dõi: chiều cao chồi, hệ số nhân nhanh, số lá/chồi thì thấy rằng môi trƣờngMS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7
40
mg/l BAP + 100 ml/l ND thích hợp cho sự sinh trƣởng của các giống hoa cúc. Tuy nhiên môi trƣờng này là tối ƣu nhất cho giống cúc Mai vàng.
2. Kiến nghị
Từ kết quả nghiên cứu tạo vật liệu in vitro để hoàn thiện quy trình nhân giống cúc của các giống khác nhau đặc biệt là các giống chất lƣợng cao.
Ứng dụng mô hình nhân giống in vitro hoa cúc vào thực tế sản xuất để cung cấp số lƣợng cây giống lớn, giá thành rẻ.
41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Tài liệu tiếng Việt
[1]. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, (Giáo trình cao học nông nghiệp), Nxb nông nghiệp Hà Nội.
[2]. Võ Văn Chi, Dƣơng Đức Tiến (1978), Phân loại thực vật (Thực vật bậc cao), Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp.
[3]. La Việt Hồng, Phạm Thị Tƣơi, Dƣơng Thị Minh và cộng sự (2014), Xây dựng quy trình nhân giống hoa cúc CN01 (Chrysanthemum maximum seiun – 3), Tạp chí khoa học trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, 29 : 28 -