2.3.2.1. Hình thức
Đánh giá các tính chất cảm quan của sản phẩm đông khô gồm: màu sắc, độ mịn, độ xốp, độ đồng đều, kích thước các hạt kết tinh.
2.3.2.2. Định lượng bằng phương pháp đo quang
Cơ chế: Protein hấp thụ mạnh ánh sáng trong vùng tử ngoại với hai cực đại hấp thụ ở bước sóng 280 nm và 200 nm nhờ sự có mặt của các amino acid chứa nhân thơm gồm phenylalanin, tryptophan, histidin và tyrosin. Nồng độ các amino acid này thay đổi khá nhiều ở từng protein, dẫn đến sự khác nhau về độ hấp thụ riêng tại bước sóng hấp thụ cực đại. Độ hấp thụ riêng E (1%, 1cm) thường rơi vào khoảng từ 4 đến 15, trong đó E (1%, 1cm) tại bước sóng hấp thụ cực đại 280 nm của ovalbumin trứng gà bằng 7 [32].
Cách tiến hành:
Dung dịch ovalbumin tinh chế cuối cùng trước khi đông khô thu được từ mỗi phương pháp tinh chế được pha loãng với nước với hệ số pha loãng thích hợp, đo độ hấp thụ quang tại bước sóng λ = 280nm.
A = ε.C.l (1) Trong đó:
A: là độ hấp thụ quang (Abs).
ε: là hệ số hấp thu phân tử (M-1cm-1)
C: là nồng độ dung dịch (mol/l). l: chiều dày cuvet (cm)
Khi dung dịch có nồng độ 1% được đo độ hấp thụ tại một bước sóng xác định và chiều dài cuvet l = 1cm, độ hấp thụ quang khi đó của dung dịch là độ hấp thụ riêng E(1%, 1cm). Công thức tính độ hấp thụ quang A theo E(1%, 1cm):
A = E(1%, 1cm).C
Độ hấp thụ riêng E (1%, 1cm) của ovalbumin bằng 7, do đó, nồng độ ovalbumin trong dung dịch được tính theo công thức sau:
C (%) = 7 (2)
2.3.2.3. Đánh giá hiệu suất tinh chế ovalbumin
Hiệu suất tách ovalbumin từ lòng trắng trứng (H%) được tính theo công thức sau:
H (%) = .100 (3) Trong đó:
- m2: khối lượng ovalbumin trong sản phẩm được định lượng bằng phương pháp đo quang.
- m1: khối lượng ovalbumin có trong lòng trắng trứng. Khối lượng này được tính dựa trên số liệu phân tích gần đây nhất các thành phần của lòng trắng trứng (chứa 10,95% protein, trong đó ovalbumin chiếm 54%) [3].
2.3.2.4. Định tính và đánh giá độ tinh khiết
Hệ thống điện di trên gel polyacrylamid natri dodecyl sulfat (SDS-PAGE) và phần mềm ImageJ được sử dụng để định tính, đánh giá độ tinh khiết của ovalbumin tinh chế được.
Cơ chế: Trong điện trường, tốc độ di chuyển của các chất phụ thuộc vào
điện tích, kích thước phân tử của chất đó và cường độ điện trường. Trong đó, điện tích của một protein phụ thuộc vào thành phần amino acid của nó. Protein tồn tại ở trạng thái xoắn và gấp khúc nhờ các liên kết disulfid, do đó kích thước phân tử của protein không phụ thuộc bởi khối lượng phân tử của protein đó. Vậy nên các phân tử protein tự nhiên khác nhau có cùng khối lượng phân tử có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong cùng một điện trường. SDS được thêm vào đệm điện di cùng với những chất khử như DDT (dithiotheitol) hoặc B-ME (β- mercaptoethanol) để phá vỡ các liên kết disulfid trong protein, biến protein từ dạng cấu trúc bậc 3 về dạng thẳng. SDS đồng thời tích điện âm cho protein làm cho điện tích của phân tử protein lớn hơn hẳn điện tích có sẵn của nó. SDS bám lên protein theo một tỷ lệ ổn định, làm cho điện tích mới của phân tử protein tỷ lệ với khối lượng phân tử của nó. Lúc này, yếu tố duy nhất ảnh hưởng tới tốc độ di chuyển của các phân tử protein được biến tính bởi SDS là khối lượng phân tử của chúng. Do đó các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau được phân biệt [27].
Hình 2.5. DDT đóng vai trò phá vỡ các liên kết disulfid [27]
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị bộ đệm mẫu gồm 2% SDS, 20% glycerol, 20 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2mM EDTA, 160 mM dithiothreitol (DDT) và 0,1 mg/ml thuốc nhuộm xanh bromphenol.
- Chuẩn bị mẫu protein theo công thức trong bảng 2.2:
Bảng 2.2. Công thức chuẩn bị mẫu điện di Thành phần Thể tích (µl)
Protein 4
Nước tinh khiết 28
SDS sample buffer 8
- Biến tính mẫu ở nhiệt độ 95oC trong thời gian 10 phút, sau đó tiến hành ly tâm loại bỏ kết tủa.
- 15 µl mỗi mẫu protein và marker được tra lần lượt vào các giếng của bản gel polyacrylamid 12%. Chạy điện di với dòng điện 140V, 300 mA trong 2,5 giờ trên thiết bị điện di AE-6500Dual.
- Để đọc kết quả điện di, gel được để qua đêm và nhuộm bằng thuốc nhuộm Coomassie Blue.
Kết quả định tính dựa trên so sánh vị trí các băng trên hình ảnh gel của mẫu protein với vị trí các băng của marker.
Độ tinh sạch của protein được tính toán bằng phần mềm ImageJ dựa trên mật độ của băng protein trên hình ảnh gel [3].
Công thức:
P =
ổ . 100 (4) Trong đó:
- P: độ tinh khiết (%).
- Sova: Diện tích pic ovalbumin được tính bắng phần mềm.
- Stổng: Diện tích tất cả các pic của các chất được tính trên phần mềm. 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả được tính toán và xử lý trên phần mềm Excel 2007 và phần mềm ImageJ.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát các phương pháp tinh chế albumin trứng
Tiến hành tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng bằng các phương pháp khác nhau, thu được các mẫu sản phẩm ovalbumin, trong đó:
- Mẫu 1: thu được từ phương pháp được mô tả trong mục 2.3.1.1. - Mẫu 2: thu được từ phương pháp được mô tả trong mục 2.3.1.2.
- Mẫu 3: mẫu không lọc tiếp tuyến, biến tính ở 70oC thu được từ phương pháp được mô tả trong mục 2.3.1.3
- Mẫu 4: mẫu sau khi lọc tiếp tuyến, biến tính ở 70oC thu được từ phương pháp được mô tả trong mục 2.3.1.3.
Kết quả được thể hiện trong hình 3.1 và bảng 3.1:
Hình 3.1. Sản phẩm đông khô thu được từ các phương pháp tinh chế ovalbumin trứng
Nhận xét: Về cảm quan, các sản phẩm ovalbumin đông khô thu được từ 3
phương pháp đều có màu trắng, ở trạng thái khô, tơi và xốp. Độ mịn và độ xốp của các mẫu ovalbumin tinh chế được là khác nhau: Ovalbumin thu được từ phương pháp thay đổi pH (được mô tả trong mục 2.3.1.1) và phương pháp phân lập từng bước protein, có sử dụng màng lọc tiếp tuyến (được mô tả trong mục 2.3.1.3) có độ mịn cao hơn, tơi hơn và kích thước các tinh thể đồng đều hơn. Ngược lại, ovalbumin thu được từ phương pháp sử dụng dung dịch amoni sulfat
bão hòa (được mô tả trong mục 2.3.1.2) và phương pháp phân lập protein từng bước nhưng không dùng màng lọc tiếp tuyến (được mô tả trong mục 2.3.1.3) xốp hơn, các tinh thể có kích thước lớn và không đồng đều.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát các phương pháp tinh chế ovalbumin trứng
Mẫu Khối lượng lòng trắng trứng (g) Khối lượng ovalbumin có trong lòng trắng trứng (g) Khối lượng sản phẩm đông khô thực tế thu được (g) Khối lượng ovalbumin trong sản phẩm đông khô (g) Hiệu suất tách (%) 1 10,360 0,593 0,216 0,098 16,53 2 10,138 0,599 2,562 0,445 74,29 3 10,041 0,593 1,581 0,521 87,86 4 10,154 0,600 0,592 0,524 87,33
Nhận xét: Kết quả khảo sát (bảng 3.1) cho thấy, sử dụng phương pháp thay đổi pH dung dịch về điểm đẳng điện của protein để tách ovalbumin từ lòng trắng trứng cho hiệu suất tách thấp (chỉ 16,52%). Dung dịch HCl 1M dùng để điểu chỉnh pH sẽ dễ dàng bay hơi trong quá trình đông khô, do đó sản phẩm đông khô thu được chứa chủ yếu là các thành phần của lòng trắng trứng. Như vậy, với hàm lượng 0,098g trong tổng số 0,216g khối lượng sản phẩm đông khô, ovalbumin tách được bằng phương pháp này bị lẫn rất nhiều protein khác của lòng trắng trứng.
Sản phẩm đông khô thu được từ hai phương pháp còn lại chứa một lượng muối amoni sulfat cao, đặc biệt đối với phương pháp dùng amoni sulfat bão hòa (protein chiếm khoảng 11% khối lượng lòng trắng trứng, trong khi đó lượng sản phẩm khô thu về lên đến 2,562g). Trên thực tế, các protein khác nhau bị kết tụ ở các nồng độ muối khác nhau, mặt khác quá trình kết tụ này không hoàn toàn phụ thuộc tuyến tính bởi nồng độ muối thêm vào. Do đó, để lựa chọn một lượng dung dịch amoni sulfat tối ưu, đảm bảo vừa tách được ovalbumin với hiệu suất
cao vừa ít gây kết tụ đồng thời các protein khác là tương đối khó khăn. Hơn nữa, việc loại bỏ hoàn toàn một lượng muối lớn còn lại trong sản phẩm cũng gặp nhiều trở ngại, và khó để đảm bảo protein không bị thay đổi sau quá trình biến tính.
Phương pháp tách lần lượt từng protein cho hiệu suất thu hồi ovalbumin cao nhất (trên 87%), lượng muối amoni sulfat được sử dụng là rất thấp (chỉ 5% w/v để tách ovotransferrin). So sánh khối lượng sản phẩm đông khô và khối lượng ovalbumin đo được bằng phương pháp đo quang cho thấy sự khác nhau không nhiều, chứng tỏ hầu hết amoni sulfat được loại bỏ qua màng lọc tiếp tuyến.
Từ những kết quả trên, chúng tôi lựa chọn quy trình 2.3.1.3 để tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng. Dung dịch sau khi được lọc tiếp tuyến có thể còn có lẫn các thành phần protein khác, đồng thời ovalbumin ngoài ra còn có thể tồn tại ở cả dạng cấu trúc S-ovalbumin có sức đề kháng cao hơn với nhiệt, do đó tiến hành một khảo sát biến tính trên 4 mẫu dung dịch (sau bước loại muối) tại 4 điểm nhiệt độ khác nhau: 70oC, 75oC , 80oC và 85oC.
3.2. Tinh chế ovalbumin bằng cách loại từng bước các protein có trong lòng trắng trứng và đánh giá một số chỉ tiêu của ovalbumin tinh chế được lòng trắng trứng và đánh giá một số chỉ tiêu của ovalbumin tinh chế được
3.2.1. Định tính sản phẩm tinh chế được
Tiến hành tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng theo phương pháp mô tả trong mục 2.3.1.3. Để xác định các protein có trong sản phẩm thu về, tiến hành theo phương pháp được mô tả trong mục 2.3.2.4 với các mẫu:
- Mẫu 1: Dung dịch LTT pha loãng 2 lần với nước. - Mẫu 2: Dịch lỏng sau khi loại ovomucin.
- Mẫu 3: Dịch lỏng (S1) sau khi loại ovotransferrin. - Mẫu 4: Dịch lỏng (S2) sau khi loại ovotransferrin. - Mẫu 5: Dung dịch sau bước lọc tiếp tuyến.
- Mẫu 6, 7, 8, 9: Dịch lỏng sau khi biến tính ở 75oC, 70oC, 80oC và 85oC. Kết quả chạy điện di được thể hiện trong hình 3.2:
Hình 3.2. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu thu được từ các bước
Giếng 1: mẫu 1. Giếng 2: mẫu 2. Giếng 3: mẫu 3. Giếng 4: mẫu 4. Giếng 5: mẫu 5. Giếng 6, 7, 8, 9: mẫu 6, 7, 8, 9. Giếng 10: marker
Nhận xét: So sánh hình ảnh điện di của mẫu 1, 2 với các mẫu 3 – 9 cho thấy một lượng lớn ovotransferrin đã được loại khỏi dung dịch sau bước xử lý với amoni sulfat và acid citric. Điều này chỉ ra rằng việc kết hợp acid citric giúp làm giảm nồng độ muối sử dụng và cho hiệu quả loại bỏ ovotransferrin cao. Tuy nhiên, quan sát hình ảnh điện di ở giếng 4 có thể thấy một lượng nhỏ ovalbumin cũng bị kết tủa đồng thời với ovotransferrin.
Ngoài ovalbumin, 2 protein khác có khả năng đề kháng tương đối tốt với nhiệt là lysozym (biến tính ở 75oC) và ovomucoid (biến tính ở 77oC). Hai protein này có khối lượng phân tử nhỏ (14,3 kDa và 28 kDa) do đó sẽ bị loại bỏ qua màng lọc tiếp tuyến 30 kDa (so sánh hình ảnh điện di ở giếng 5 so với giếng 1, 2, 3).
Từ giếng số 6 – 9, hình ảnh trên gel điện di cho thấy sự khác biệt rõ rệt so với giếng số 5. Các tạp chất chính (ngoại trừ ovotransferrin) gồm ovomucoid, lysozym, globulin, avidin hầu như bị loại khỏi dung dịch. Điều này chứng tỏ nhiệt độ có tác động rất lớn trong việc tinh sạch các protein khác ra khỏi ovalbumin.
Các giếng 6, 7, 8 cho thấy rõ băng điện di của ovalbumin và lẫn một số lượng ít tạp chất là ovotransferrin. Ở nhiệt độ 70oC, hầu hết các tạp protein còn lại đều đều bị kết tủa hết ngoại trừ ovotransferrin. Từ giếng 7, 6, 8, 9, ovotransferrin dần được loại bỏ nhờ kết tủa bởi nhiệt. Đồng thời băng ovalbumin nhạt dần khi tăng nhiệt độ, ovalbumin bắt đầu có dấu hiệu kết tủa khi tăng nhiệt độ lên 75oC, và bị kết tủa mạnh tại nhiệt độ 80oC. Ở 85oC, ovalbumin gần như bị kết tủa hoàn toàn, băng điện di xuất hiện mờ trên giếng 9 có thể là của cấu trúc S-ovalbumin.
3.2.2. Hiệu suất tinh chế ovalbumin
Tiến hành tinh chế ovalbumin theo phương pháp được mô tả trong mục 2.3.1.3 với khối lượng lòng trắng trứng ban đầu là 100 g. Định lượng ovalbumin trong dung dịch sau khi biến tính ở nhiệt độ 70oC, 75oC, 80oC, 85oC bằng phương pháp mô tả trong mục 2.3.2.2. Hiệu suất tinh chế được tính toán theo công thức (3) được mô tả trong mục 2.3.2.3:
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất tinh chế ovalbumin
Nhiệt độ (oC) 70 75 80 85
Ovalbumin (g) 0,689 0,416 0,345 0,217
Hiệu suất (%) 87,33 52,79 43,71 16,06
Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy, hiệu suất tinh chế ovalbumin bắt
đầu giảm mạnh khi tăng nhiệt độ từ 70oC lên 75oC. Khi tăng dần nhiệt độ biến tính, khả năng đề kháng với nhiệt của ovalbumin giảm, do đó lượng ovalbumin bị kết tủa đồng thời cùng các tạp protein khác tăng, hiệu suất tách ovalbumin từ
lòng trắng trứng giảm. Khi biến tính ovalbumin chỉ còn 16,06%, gi
biến tính 70oC (87,33%)
3.2.3. Độ tinh khiết của ovalbumin
Các mẫu sau khi biến tính bởi nhiệt nh tâm, thu lấy dịch lỏng v
độ tinh khiết của ovalbumin phần mềm ImageJ. Công th Kết quả được thể hiện trong
Biến tính loại tạp ở 70
Biến tính loại tạp ở
Hình 3.3. Kết quả đo mật độ h
ắng trứng giảm. Khi biến tính ở nhiệt độ 85oC, hiệu suất tinh chế 16,06%, giảm hơn 5 lần khi so sánh với giá trị
(87,33%).
ộ tinh khiết của ovalbumin
ẫu sau khi biến tính bởi nhiệt như mô tả trong mục 2.3.1.3 đ ấy dịch lỏng và đông khô. Sản phẩm đông khô được tiến h
ộ tinh khiết của ovalbumin dựa trên tính toán mật độ hình ảnh
Công thức tính độ tinh khiết được mô tả trong mục ợc thể hiện trong hình 3.3 và bảng 3.3:
ến tính loại tạp ở 70oC Biến tính loại tạp
ến tính loại tạp ở 80oC Biến tính loại tạp ở 85
ết quả đo mật độ hình ảnh các băng điện bi bằng phần mềm ImageJ
ệu suất tinh chế ần khi so sánh với giá trị này ở nhiệt độ
ả trong mục 2.3.1.3 được ly ợc tiến hành đánh giá ảnh trên bản gel bằng ả trong mục 2.3.2.4. ến tính loại tạp ở 75 oC ến tính loại tạp ở 85 oC ảnh các băng điện bi bằng phần mềm
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của ovalbumin
Nhiệt độ (oC) 70 75 80 85
Độ tinh khiết(%) 91,03 91,78 94,28 100
Nhận xét: Sau khi loại tạp protein bằng bước biến tính nhiệt, các mẫu ovalbumin tinh chế đều có độ tinh khiết cao (trên 91%). Độ tinh khiết của ovalbumin tinh chế được tăng theo giá trị nhiệt sử dụng để biến tính, tuy nhiên để lựa chọn nhiệt độ biến tính thích hợp cần xem xét đến hiệu suất thu hồi ovalbumin.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ biến tính lên hiệu suất tách và độ tinh khiết của ovalbumin
Theo như hình 3.4: Độ tinh khiết của sản phẩm sau khi loại tạp bằng biến tính tại nhiệt độ 70oC và 75oC có sự khác nhau không nhiều (91,03% và 91,78%) tuy nhiên hiệu suất thu hồi ovalbumin giảm gần một nửa. Ovalbumin có độ tinh khiết trên 94% sau khi biến tính ở nhiệt độ trên 80oC nhưng lượng ovalbumin hao phí là quá lớn, đặc biệt sau khi biến tính ở 85oC, mặc dù độ tinh khiết của
0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 70 75 80 85 Độ ti nh khi ết (%) Hiệu suấ t (%) Nhiệt độ (oC) Hiệu suất Độ tinh khiết
ovalbumin tinh chế được là gần như 100% nhưng lượng ovalbumin thu hồi chỉ khoảng 16% lượng ovalbumin có trong nguyên liệu thô.
Từ những kết quả trên trên, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 70oC để biến tính loại tạp và hoàn thiện quy trình tinh chế ovalbumin từ lòng trắng trứng như hình 3.5:
Điều chỉnh pH về 4,75 bằng dung dịch HCl 3M, để yên trong 2h.