Cĩ 3 nguyên tắc căn bản
1. Khơng để sĩt lại (not remaining). Vệ sinh hoặc thanh trùng hoặc lọc… để bảo đảm rằng khơng cịn tế bào vi sinh vật tạp nhiễm nào trong thiết bị, mơi trường trước khi nuơi cấy.
2. Khơng để xâm nhập vào (not entering). Bảo đảm rằng trong quá trình vận hành khơng cĩ sự xâm nhiễm từ bên ngồi vào mơi trường hay thiết bịđang nuơi cấy.
3. Khơng để lây lan (not spreading). Ngăn chặn khơng cho vi sinh vật tạp nhiễm lây lan trong mơi trường thao tác, hoặc ngăn chặn sư lây lan một khi cĩ tạp nhiễm xảy ra.
Thực hành phịng chống tạp nhiễm
- Thường xuyên vệ sinh thiết bị trước khi thanh trùng. Thơng thường người ta dùng NaOH lỗng 3~5% hoặc HNO3 lỗng 0,5~1% để rữa, làm sạch tồn bộ cặn bả (scale) cịn lại từ mẻ nuơi cấy trước trong thiết bị lên men.
- Thường xuyên kiểm tra sự rị rỉ của thiết bị (nồi lên men, van, đường ống, các mối hàn …). Các phương pháp kiểm tra như nạp khí nén cao áp vào thiết bị rồi dùng
nước xà phịng xịt bên ngồi để kiểm tra, hoặc phương pháp dùng chỉ thị màu như nạp khí nén áp suất 0,5-4,0 kgf/cm2 cĩ chứa NH3 với nồng độ thấp vào thiết bị rồi phủ giấy cĩ tẩm phenolphtalein bên ngồi thiết bị ở các mối nối, đường hàn… để nhận diện sự rị rỉ. Khi cĩ sự rị rỉ, NH3 từ bên trong thiết bị sẽ khuếch tán ra và được giữ lại trên giấy cĩ tẩm phenolphtalein làm giấy đổi sang màu hồng. Đối với các thiết bị trao đổi nhiệt bề mặt, người ta phát hiện các vết nứt bằng cách dùng chất chỉ thị màu; gồm 3 chất căn bản (bộ kit): 1. Chất tẩy sạch bề mặt; 2. Chất nền thấm vào trong các vết nứt; 3. Chất hiển thị màu khi phản ứng với chất thứ 2. Sau khi phun chất thứ 2 lên bề mặt thiết bị, dùng vải khơ lau sạch, sau đĩ phun chất thứ 3. Ở vị trí nào cĩ xuất hiện màu chỉ thị, ở đĩ đã bị nứt hoặc rị rỉ.
- Thường xuyên kiểm tra độ chính xác của các thiết bị đo đạc như thiết bịđo nhiệt độ, áp suất, thời gian, lưu lượng… bằng cách so sánh với các dụng cụđo chuẩn.
- Phải bảo đảm việc vận hành thanh trùng đúng qui trình và các điều kiện thanh trùng thích hợp.
- Trong một số trường hợp chủng tạp nhiễm chịu nhiệt, cĩ khả năng tạo bào tử nên rất khĩ xử lý. Nhằm loại bỏ triệt để các bào tử cịn tồn tại trong nồi lên men cần sử dụng phương án “thanh trùng-nuơi cấy-thanh trùng”. Nguyên tắc của phương pháp này là sau khi thanh trùng nồi lên men, chuẩn bị một mơi trường tổng hợp cĩ thành phần dinh dưỡng đơn giản bao gồm các nguồn dinh dưỡng C, N, P, Mg, amino acid với nồng độ thấp, điều chỉnh pH 7,0-7,5, nhiệt độ 30-35oC và tiến hành khuấy trộn, sục khí trong vịng khoảng 3-4 giờ. Đây là điều kiện thích hợp để các bào tử của chủng tạp nhiễm cịn tồn tại trong nồi sẽ “nở” (germination) thành tế bào sinh dưỡng. Sau đĩ, lập tức xả bỏ tồn bộ dịch nuơi cấy này và tiến hành thanh trùng thiết bị ngay nhằm diệt bỏ các tế bào tạp khuẩn cịn lại trong nồi lên men. Khi cần thiết cĩ thể lặp lại qui trình này 2~3 lần.
5. Cách phát hiện - đánh giá nguồn gốc tạp nhiễm
Việc phát hiện tạp nhiễm cĩ thể thơng qua nhiều phương pháp như đã trình bày trên đây tuy nhiên trong nhiều trường hợp cần phân tích phối hợp đồng thời nhiều phương pháp mà trong đĩ quan trọng nhất là kiểm tra tạp nhiễm theo cách sử dụng đĩa pettri chứa mơi trường tổng hợp. Trong quá trình nuơi cấy, theo thời gian, cần lấy mẫu và tiến hành kiểm tra trên đĩa petrri bằng cách hút khoảng 1ml dịch nuơi cấy trãi lên mặt đĩa và ủở nhiệt độ thích hợp (~37-390C), nếu cĩ khuẩn lạc lạ xuất hiện, cĩ thể hiện tượng tạp nhiễm đã xảy ra. Ghi nhận số lượng khuẩn lạc lạ này và thực hiện đánh giá qua các thơng số: hình thái, số lượng tế bào, khả năng tạo bào tử, đặc tính di động… và thời gian thế hệ. Trên cơ sở thời gian thế hệ, số lượng và loại tế bào tạp nhiễm tại thời điểm đánh giá, ta cĩ thể tính được thời điểm tạp nhiễm bắt đầu xảy ra tại trong trong quá trình lên men, từđĩ cĩ thể phân tích được khả năng nguồn gây nhiễm là từđâu. Khi phân tích nguồn gốc tạp nhiễm cần tiến hành theo các bước sau đây.
1) Cĩ thể do cịn vi khuẩn tạp nhiễm tồn tại trong thiết bị hoặc/và mơi trường mà nguyên nhân là do hoạt động thanh trùng khơng triệt để (remaining).
+ Do khơng đủ nhiệt độ/ thời gian thanh trùng (thiết bị cảm biến bị hư hỏng, khơng bảo đảm độ chính xác theo yêu cầu.
+ Do cĩ sự tồn tại lớp vảy cặn bám trong thành thiết bị (scale), làm nơi “trú ẩn” tốt cho các vi sinh vật tạp nhiễm tồn tại.
+ Do trong thiết bị/ mơi trường cĩ sự hiện diện của các chủng tạp nhiễm chịu nhiệt nên khi thanh trùng với điều kiện như thường lệ thì khả nguy cơ tế bào các chủng này cịn lại là rất lớn.
+ Do thiết bị thanh trùng mơi trường liên tục (thiết bị gia nhiệt sơ cấp,
Hình 5. 4) bị rị rỉ dẫn đến cĩ sự trộn lẫn giữa mơi trường chưa được thanh trùng (đầu vào) và mơi trường đã được thanh trùng (đầu ra).
+ Do mật độ tế bào tạp nhiễm trong các thành phần nguyên liệu quá lớn, khả năng thanh trùng triệt để giảm.
2) Cĩ thể giống cĩ chứa các tế bào tạp nhiễm hoặc hoạt động thao tác nạp giống gây nên tạp nhiễm.
+ Do nguồn giống nạp vào nồi lên men đã bị tạp nhiễm bởi quá trình nhân giống/ chuẩn bị giống.
+ Do hoạt động nạp giống vào nồi lên men khơng đúng thao tác gây nên tạp nhiễm.
3) Cĩ thể do vi khuẩn tạp nhiễm thâm nhập vào trong quá trình nuơi cấy mà nguyên nhân là do thiết bị bị rị rỉ (van, mối hàn …), màng lọc (hệ thống lọc khí) bị hư hỏng hoặc do thao tác vận hành của nhân viên kỹ thuật trong quá trình lên men khơng phù hợp (entering).
+ Thiết bị bị rị rỉ: van, mối hàn, roong đệm bề mặt ở các vị trí liên kết thiết bị bị bể hoặc bị lỏng ra trong quả trình vận hành. Đặc biệt là thiết bị giải nhiệt bị rị rỉ sẽ gây hiện tượng tạp nhiễm nghiêm trọng do nguồn nước giải nhiệt chứa rất nhiều vi khuẩn tạp nhiễm cĩ thể thâm nhậm vào dịch lên.
+ Màng lọc khơng khí cung cấp cho nồi lên men bị hư hỏng dẫn đến việc khơng khí chưa được lọc triệt để được nạp vào nồi lên men trong quá trình nuơi cấy.
+ Hoạt động vận hành của nhân viên kỹ thuật khơng đúng tuần tự các thao tác chuẩn dẫn đến việc dịch/ khơng khí bên ngồi hoặc từ các qui trình khơng bảo đảm vơ trùng thâm nhập vào nồi lên men trong quá trình nuơi cấy.
Ví dụ: Trong nuơi cấy mầm (nhân giống- seed cultivation) lên men sản xuất lysine với thể tích dịch là 10KL, tỷ lệ nạp giống là 0,002%. Theo thời gian người ta ghi nhận được tại giờ nuơi cấy thứ 14 và 16 số tế bào tạp nhiễm của cùng một loại xuất hiện trên đĩa pettri tương ứng là 21 và 95. Hãy đánh giá thời điểm bắt đầu xảy ra tạp nhiễm và khả năng nguồn gốc tạp nhiễm.
Ta cĩ thể tính được tg=120/log2(95/21) =~55 phút (~0,918 giờ).
Như vậy thời điểm mà trong 1 ml dịch nuơi cấy cĩ 1 tế bào tạp nhiễm là (cĩ thể phát hiện được): 14-0,918×log2 (21/1) = ~10 giờ.
Tại thời điểm bắt đầu nuơi cấy, trong nồi lên men cĩ 10× 106/214/0,918 = 258 tế bào. Trên cơ sở này ta cĩ thể nhận xét về nguồn tạp nhiễm:
1. Tạp nhiễm đã xuất hiện ngay từ khi bắt đầu nuơi cấy. 2. Nguồn gốc của tạp nhiễm
- Khơng phải từ nguồn nguồn giống. Vì thể tích giống nạp vào là 0,002%×10 KL = 200 ml. Do vậy, trong dịch giống nạp vào cĩ 258/200 = 1,3 tế bào / ml, tức là cĩ hơn 1 tế bào tạp nhiễm /1 ml dịch giống mầm. Với tỷ lệ này chắc chắn sẽ được phát hiện trong quá trình kiểm tra khi kết thúc giai đoạn chuẩn bi giống.
- Do sự tạp nhiễm là của một chủng duy nhất nên khả năng cĩ thể là do hoạt động thanh trùng khơng hiệu quả. Khơng phải do thiết bị thanh trùng mơi trường sơ cấp bị rị rỉ vì nếu thiết bị này bị rị rỉ thì cĩ sự trộn lẫn của mơi trường đã thành trùng với mơi trường chưa thanh trùng, mà trong mơi trường chưa thanh trùng thì khơng chỉ cĩ một chủng gây tạp nhiễm. Khơng phải do trong thành phần nguyên liệu cĩ hàm lượng tạp nhiễm tổng số cao mà cĩ thể là do cĩ chủng chịu nhiệt hiện diện trong hệ thống thiết bị hoặc trong thành phần nguyên liệu dù chỉ với mật độ thấp. Do vậy, cần cĩ tiến hành các hoạt động kiểm tra cĩ thiết bị cĩ liên quan đến quá trình chuẩn bị mơi trường và quá trình thanh trùng thiết bị như:
+ Kiểm tra các thiết bị cảm biến nhiệt độ hiển thị cĩ chính xác hay khơng. + Kiểm tra và vệ sinh các lớp vảy cặn bám vào thiết bị.
+ Kiểm tra lại các bước thao tác vận hành của nhân viên kỹ thuật.
6. Một sốđiểm cần lưu ý khi truy tìm nguồn gốc gây tạp nhiễm
Chủng tạp nhiễm thường gặp trong quá trình lên men là thuộc họ Bacillaceae với đặc điểm là di động, tạo bào tử, chịu nhiệt, phát triển nhanh. Nguồn gốc cĩ thể từ các nguyên liệu thơ (raw materials) hoặc trong các thiết bị do thanh trùng khơng triệt để.
Nếu chủng tạp nhiễm là thuộc họ Micrococcus thì nguồn gốc cĩ thể từ hệ thống lọc khí, hệ thống nước giải nhiệt.
Nếu trong nồi lên men tồn tại từ hai chủng tạp nhiễm trở lên với số lượng nhiều và thời gian thế hệ trung bình của các chủng tạp nhiễm ngắn thì cĩ thể suy đốn là do thiết bị bị rị rỉ (hệ thống thanh trùng, hệ thống lọc khí, hệ thống giải nhiệt …)
Cần nghiên cứu thêm động học của sự tác động nhiệt khi thanh trùng đối với vi sinh vật.
CHƯƠNG 9. THU HỒI VÀ TINH CHẾ SẢN PHẨM LÊN MEN
1. Giới thiệu
Chiết tách và tinh sạch sản phẩm lên men là một qui trình rất phức tạp, khĩ thực hiện và chi phí rất cao. Người ta cố gắng thu nhận sản phẩm cĩ chất lượng cao trong thời gian ngắn với chi phí đầu tư và chi phí vận hành thấp nhất. Trong thực tế, chi phí thu hồi sản phẩm lên men chiếm từ 15% -70% tổng giá thành của sản phẩm. Do vậy, việc chọn lựa qui trình cơng nghệ thu hồi là rất quan trong và tùy thuộc vào đặc trưng của từng loại sản phẩm.
Nếu phân tích dịch lên men tại thời điểm thu nhận thì cĩ thể thấy trong dịch cĩ chứa: sản phẩm mục tiêu với nồng độ thấp (nếu là sản phẩm ngoại bào), tế bào nguyên vẹn, tế bào bị vỡ, các chất tan và khơng tan của mơi trường nuơi cấy cịn lại và các sản phẩm trao đổi chất khác. Sản phẩm cũng cĩ thể là nằm bên trong tế bào, nhạy cảm với nhiệt hoặc dễ dàng bị phá vỡ cấu trúc do các chủng vi sinh vật tạp nhiễm. Tồn bộ những yếu tố này gĩp phần làm tăng mức độ khĩ khăn cho quá trình thu hồi. Để bảo đảm cho việc thu hồi hoặc tinh sạch sản phẩm tốt thì tốc độ vận hành cũng là yếu tố quan trọng do một số sản phẩm cĩ tính nhạy cảm cao. Do vậy qui trình thiết bị phải phù hợp để bảo đảm rằng việc thu hồi sản phẩm được thực hiện trong một khoảng thời gian thích hợp nhất. Sự chọn lựa qui trình thu hồi dựa trên các tiêu chí sau:
1. Xác định loại mơi trường lên men (rắn, bán rắn hay mơi trường lỏng) 2. Sản phẩm thu nhận là nội bào hay ngoại bào
3. Nồng độ của sản phẩm trong dịch lên men
4. Đặc tính lý - hĩa của sản phẩm (giúp cho việc chọn lựa phương án tách) 5. Mục đích sử dụng của sản phẩm
6. Độ tinh khiết thấp nhất cĩ thể chấp nhận được
7. Tầm quan trọng của độc tính sinh học của sản phẩm và của dịch lên men. 8. Độ tạp chất trong dịch lên men
9. Giá cả thị trường của sản phẩm
Mục đích chính của giai đoạn đầu trong quá trình thu hồi sản phẩm ngoại bào là loại bỏ các hạt tử rắn cĩ kích thước lớn và tế bào vi sinh vật. Thơng thường người ta sử dụng hệ thống thiết bị là máy ly tâm hoặc máy lọc. Cơng đoạn tiếp theo là dịch lên men được phân đoạn hoặc được chiết tách nhờđưa vào hệ thống phân đoạn chính, cĩ thể là hệ thống lọc tinh, hệ thống đảo chuyển áp suất thẩm thấu, hấp phụ, trao đổi ion, lọc gel, sắc ký, chiết tách hệ dịch lỏng-dịch lỏng, chiết tách dịch lỏng hai phase hoặc đơng tụ. Sau cùng, các phân đoạn cĩ chứa sản phẩm mục tiêu sẽđược tinh chế bằng cách đơng tụ phân đoạn và đạt được độ tinh sạch cao thì dùng kỹ thuật sắc ký và kết tinh để thu hồi sản
phẩm. Việc thu hồi một số sản phẩm khác cĩ thể biến đổi một vài cơng đoạn trong qui trình chính này (Hình 9.1).
Cĩ thể thay đổi một sốđặc tính của dịch sau lên men qua đĩ cĩ thể vận hành xử lý nhanh hơn với một qui trình đơn giản hơn nhờ một số kỹ thuật sau:
1. Chọn lựa chủng vi sinh vật khơng sinh tổng hợp các chất màu hoặc các chất trao đổi khơng muốn.
2. Thay đổi điều kiện lên men nhằm giảm thiểu sự sản xuất các sản phẩm trao đổi chất khơng mong muốn.
3. Xác định chính xác thời điểm thu hồi thích hợp nhất. 4. Kiểm sốt pH sau khi dừng lên men
5. Xử lý nhiệt độ sau khi dừng lên men 6. Bổ sung các chất gây kết tụ
7. Dùng enzymes phá thành tế bào
Cần phải lưu ý rằng lên men và thu hồi sản phẩm là hai giai đoạn liên tục của một quá trình và cĩ sự tác động tương hổ. Darbyshire (1981) đã quan tâm đến vấn đề này trong qui trình thu nhận enzyme. Các thơng số liên quan bao gồm thời gian thu hoạch, sự sản xuất các phân tử màu, lực ion và thành phần mơi trường nuơi cấy. Lượng lớn dịch nổi cĩ chứa enzyme cần phải được xử lý ngay sau khi thu nhận dịch lên men, hiệu suất thu hồi enzyme cĩ thể khơng dự đốn được. Điều này gây khĩ khăn cho việc thiết lập kế hoạch thu hồi. Sự sản xuất ra các chất màu gây trở ngại lớn cho qui trình thu hồi do chúng liên kết với resin giống như các enzyme. Chất phá bọt cịn lại trong dịch lên men gây ảnh hưởng đến hệ thống lọc tinh hoặc nhựa trao đổi ion được sử dụng trong các giai đoạn của quá trình thu hồi và tinh sạch. Cần thực hiện các bước thử nghiệm để chọn ra loại chất phá bọt nào thích hợp nhất cho quá trình lên men. Hàm lượng các ion trong mơi trường sản xuất cĩ thể quá cao dẫn đến việc cần phải pha lỗng dịch nỗi sau ly tâm với nước đã được khử khống trước khi đưa dịch nỗi này vào cơng đoạn xử lý. Cơng thức mơi trường nuơi cấy được quyết định bởi các yêu cầu sản xuất, nhưng hàm lượng protein trong các mơi trường phức tạp nên được đánh giá dưới gĩc độ thu hồi sản phẩm enzyme sau lên men. Quan điểm này cũng đã được đồng tình bởi Topiwala và Khosrovi (1978), khi tái sử dụng nước cho qui trình lên men thu nhận sinh khối.
Sự thu hồi và tinh sạch nhiều hợp chất khác nhau cĩ thể thực hiện được bằng nhiều con đường khác nhau. Trong một điều kiện nhất định, việc chọn phương án nào liên quan đến việc so sánh các yếu tốđược đề cập sau đây:
1. Vốn đầu tư 2. Chi phí xử lý
4. Hiệu suất thu hồi 5. Chất lượng thành phẩm
6. Tính sẵn cĩ các kỹ thuật cơng nghệ 7. Sự phù hợp với các yêu cầu đã qui định 8. Nhu cầu xử lý chất thải