5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
2.4.6. Phương pháp xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình để tính toán, các số liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn [17].
Kiểm định giả thụyết về giá trị trung bình của hai mẫu bằng cách sử dụng hàm: t - Test: Two Sample Assuming Unequal Variences trong Excel 2010 với mức ý nghĩa = 0,05. Giá trị trung bình có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05 [3].
23
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo màng cellulose vi khuẩn của A. xylinum trong ba môi trƣờng
Vi khuẩn A. xylinum khi cho vào môi trường sẽ sử dụng chất dinh dưỡng trong môi trường để tổng hợp nên cellulose. Trong ngày đầu, vi khuẩn làm quen với môi trường, tích lũy chất dinh dưỡng và năng lượng cho các giai đoạn sinh trưởng tiếp theo. Lượng acid bắt đầu hình thành nhưng không nhiều làm cho pH môi trường giảm nhẹ. Ngày thứ 2, màng cellulose vi khuẩn bắt đầu hình thành trên bề mặt môi trường, dày lên dần và ngưng lại tại một thời điểm nhất định, khi môi trường hết chất dinh dưỡng. Độ dày của màng sẽ tùy thuộc vào thời gian nuôi cấy. Sau 3 ngày độ dày màng cellulose vi khuẩn được thể hiện như hình 3.1, hình 3.2, và hình 3.3.
Hình 3.1. Màng cellulose
vi khuẩn được nuôi trong môi trường nước dừa già
Hình 3.2. Màng cellulose
vi khuẩn được nuôi trong môi trường chuẩn
Hình 3.3. Màng cellulose
vi khuẩn được nuôi trong môi trường nước vo gạo
24
3.2. Thu màng cellulose vi khuẩn thô trong ba môi trƣờng
Các màng cellulose vi khuẩn nằm trên bề mặt môi trường, dễ tách ra khỏi môi trường nuôi cấy. Màng chứa nhiều nước, có thể chất rất dẻo dai. Với thời gian và độ dày của môi trường khác nhau có thể thụ được màng ở các độ dày mỏng khác nhau. Như vậy có thể chế tạo được màng cellulose vi khuẩn có độ dày theo ý muốn, như hình 3.4.
(a) (b)
Hình 3.4. Thu màng cellulose vi khuẩn thô ở khoảng thời gian khác nhau trong MT2
(a): Màng cellulose vi khuẩn thô có độ dày 0,3 cm với thời gian nuôi cấy 4 ngày (b): Màng cellulose vi khuẩn thôi có độ dày 0,5 cm với thời gian nuôi cấy 7 ngày
3.3. Quá trình xử lý màng cellulose vi khuẩn trƣớc khi hấp thụ thuốc
Bước 1: Thụ màng cellulose vi khuẩn thô, rửa sạch dưới vòi nước
Bước 2: Ngâm màng cellulose vi khuẩn thô trong NaOH 3% sau 48h thụ màng cellulose vi khuẩn có màu vàng nâu (Hình 3.5).
Bước 3: Tiếp tục ngâm các màng cellulose vi khuẩn đó vào trong HCl 3% sau 48h thụ được màng cellulose vi khuẩn có màu trắng ngà, không mùi (Hình 3.6).
25
Hình 3.5. Màng cellulose vi khuẩn thô được ngâm trong NaOH 3%
Hình 3.6. Màng cellulose vi
khuẩn ngâm trong HCl
Bước 4: Ngâm các màng cellulose vi khuẩn vào trong nước trong 48h để trung hòa hết acid, sau đó lấy màng ra rửa sạch dưới vòi nước ta thụ màng cellulose vi khuẩn có màu trắng trong (Hình 3.7 và Hình 3.8).
Hình 3.7. Màng cellulose vi
khuẩn được rửa dưới vòi nước
Hình 3.8. Màng cellulose vi
26
3.4. Xác định điều kiện nuôi cấy để có độ dày màng cellulose vi khuẩn thích hợp thích hợp
Mục đích: thụ màng cellulose vi khuẩn ở các độ dày khác nhau và sử dụng màng này cho những thí nghiệm ở giai đoạn sau.
Nguyên tắc: vi khuẩn A. xylinum khi cho vào môi trường sẽ sử dụng chất dinh dưỡng trong môi trường để tổng hợp nên cellulose. Màng cellulose dày lên dần và ngưng lại tại một thời điểm nhất định, khi môi trường hết chất dinh dưỡng. Độ dày của màng sẽ tùy thụộc lượng môi trường và thời gian nuôi cấy.
Thực hiện: môi trường được cho vào các bình nuôi cấy với thể tích môi trường khác nhau như sau:
Cách tiến hành: các môi trường được cho vào các bình nuôi cấy với thể tích môi trường như nhau là 150ml.
Lô 1: Môi trường nuôi cấy có chứa thành phần cao nấm men (MT1). Lô 2: Môi trường nuôi cấy có chứa thành phần nước dừa (MT2). Lô 3: Môi trường nuôi cấy có chứa thành phần nước vo gạo (MT3). Mỗi lô có 4 - 5 bình nuôi cấy, sau khoảng thời gian 3 - 5 ngày sẽ tiến hành thu màng lần 1 (mỗi lô thu khoảng 2 - 3 bình) lúc này màng có độ dày khoảng 0,25 - 0,3cm. Tiếp tục nuôi cấy tĩnh các bình còn lại ở mỗi lô cho đến khi được 6 - 8 ngày thì thu màng lúc này màng có độ dày khoảng 0,45 - 0,5cm. Kết quả thu màng tươi ở độ dày khác dày khác nhau được thể hiện qua bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả thụ màng cellulose vi khuẩn tươi ở các độ dày khác nhau Lô Thời gian
nuôi cấy (ngày)
Thể tích môi trƣờng nuôi cấy (ml) Độ dày màng thụ đƣợc (cm) 1 3 - 5 150 0,3 6 - 8 05 2 3 - 5 150 0,3 6 - 8 0,5 3 3 - 5 150 0,3 6 - 8 0,5
27
3.5. Kiểm tra độ tinh khiết của màng cellulose vi khuẩn
Mục đích: Kiểm tra sự hiện diện của đường glucose nồng độ cao trong môi trường nuôi cấy.
Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện của đường D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu đỏ.
Tiến hành:
- Mẫu thử: Dịch thử của màng cellulose vi khuẩn các loại sau khi đã được xử lý hóa học.
- Mẫu đối chứng: Là H2O cất và dung dịch D- glucose.
- Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1 ml thụốc thử Fehling. Đun cách thủy trong 10 phút.
- Quan sát kết tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
- Kết quả: Không phát hiện glucose hiện diện trong màng được thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3.9. Kết quả thử sự hiện diện của đường glucose
Mẫu thử 1: màng 0,3cm Mẫu thử 2: màng 0.5cm
3.6. Khảo sát khả năng hấp thụ thuốc của màng cellulose vi khuẩn
Cho màng cellulose vi khuẩn vào bình có chứa 100ml dung dịch (gồm 20mg thuốc cimetidine dẫn dung dịch HCl 0,1N đến 100ml) được thể hiện như hình 3.10.
28
Sau khi cho màng vào dung dịch cimetidine, đặt bình vào máy lắc với chế độ lắc 180 vòng/phút được thể hiện ở hình 3.11.
Sau các khoảng thời gian 30 phút, 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ lấy dung dịch ra đo quang phổ bằng máy UV - 2450 để xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng được thể hiện ở hình 3.12. Hình 3.10. Chuẩn bị hấp thụ thuốc cimetidine ở độ dày 0,3cm màng cellulose vi khuẩn Hình 3.11. Màng
cellulose vi khuẩn đang hấp thụ thuốc
Hình 3.12. Dung dịch
lấy ra để đo quang phổ
Kết quả đo quang phổ được trình bày trong bảng 3.2, bảng 3.3, bảng 3.4.
3.6.1. Màng chuẩn
Bảng 3.2. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng cellulose vi khuẩn
trong môi trường chuẩn (n = 3)
Độ dày màng
Đặc điểm của màng
Thời gian hấp thụ (giờ)
0,5 1 1,5 2 0,3cm Màng giữ nguyên 0,337 0,0026 0,301 0,0016 0,288 0,0017 0,276 0,0016 Màng sấy 50% 0,303 0,0027 0,278 0,0032 0,266 0,0034 0,251 0,0024 Màng sấy 100% 0,281 0,0014 0,244 0,0018 0,227 0,0017 0,211 0,0022 0,5cm Màng giữ nguyên 0,437 0,0024 0,398 0,0028 0,335 0,0021 0,304 0,0014 Màng sấy 50% 0,396 0,0022 0,334 0,0021 0,301 0,0012 0,274 0,0019 Màng sấy 100% 0,371 0,0035 0,318 0,0027 0,286 0,0026 0,237 0,0013
29
3.6.2. Màng dừa
Bảng 3.3. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng cellulose vi khuẩn
trong môi trường nước dừa già (n = 3)
3.6.3. Màng gạo
Bảng 3.4. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng cellulose vi khuẩn
trong môi trường nước vo gạo (n = 3)
Từ kết quả tính được ở bảng 3.2, 3.3, 3.4 ta có thể thấy sau 2 giờ lắc màng thì giá trị OD đo được gần như không giảm chứng tỏ lượng thuốc hấp thụ vào màng đã đạt cực đại.
Độ dày màng
Đặc điểm của màng
Thời gian hấp thụ (giờ)
0,5 1 1,5 2 0,3cm Màng giữ nguyên 0,345 0,0016 0,326 0,0012 0,322 0,0029 0,312 0,0029 Màng sấy 50% 0,324 0,0022 0,317 0,0022 0,302 0,0023 0,293 0,0023 Màng sấy 100% 0,289 0,0034 0,278 0,0020 0,265 0,0015 0,258 0,0017 0,5cm Màng giữ nguyên 0,372 0,0015 0,356 0,0017 0,332 0,0018 0,327 0,0028 Màng sấy 50% 0,347 0,0027 0,331 0,0034 0,319 0,0022 0,314 0,0021 Màng sấy 100% 0,311 0,0029 0,291 0,0026 0,289 0,0027 0,275 0,0017 Độ dày màng Đặc điểm của màng
Thời gian hấp thụ (giờ)
0,5 1 1,5 2 0,3cm Màng giữ nguyên 0,369 0,0022 0,358 0,0015 0,347 0,0012 0,332 0,0016 Màng sấy 50% 0,337 0,0028 0,322 0,0027 0,312 0,0026 0,301 0,0025 Màng sấy 100% 0,305 0,0018 0,292 0,0019 0,286 0,0023 0,273 0,0023 0,5cm Màng giữ nguyên 0,396 0,0025 0,385 0,0016 0,367 0,0029 0,351 0,0026 Màng sấy 50% 0,374 0,0029 0,352 0,0029 0,341 0,0015 0,334 0,0017 Màng sấy 100% 0,357 0,0017 0,335 0,0024 0,324 0,0027 0,311 0,0021
30
Lấy giá trị OD thu được từ bảng 3.1, 3.2, 3.3 thay vào phương trình đường chuẩn của cimetidine ta tìm được nồng độ cimetidine (%) trong dung dịch, lấy C% thay vào công thức (1) ta được khối lượng cimetidine có trong dung dịch (mct), lấy khối lượng cimetidine có trong dung dịch thay vào công thức (2) ta được khối lượng cimetidine được hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn (mht), tiếp tục lấy khối lượng cimetidine được hấp thụ vào màng thay vào công thức (3) ta được tỉ lệ thuốc cimetidine được hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn.
Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn với độ dày khác nhau tại thời điểm 2 giờ được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Lượng thuốc hấp thụ vào các màng cellulose vi khuẩn
tại thời điểm 2 giờ mht (mg) Các loại
màng
Màng giữ nguyên Màng sấy 50% Màng sấy 100%
0,3cm 0,5cm 0,3cm 0,5cm 0,3cm 0,5cm Màng chuẩn 9,69 0,0057 8,59 0,0089 10,68 0,0029 9,77 0,0047 12,24 0,0048 11,27 0,0072 Màng dừa 8,27 0,0027 7,68 0,0098 9,02 0,0037 8,19 0,0037 10,41 0,0071 9,74 0,0052 Màng gạo 7,48 0,0022 6,73 0,0012 8,71 0,0075 7,41 0,0052 9,81 0,0042 8,31 0,0022 Bảng 3.5 cho thấy trong cùng một loại màng thì lượng thuốc hấp thụ được vào các màng có độ dày 0,3cm nhiều hơn so với màng cellulose vi khuẩn có độ dày 0,5 cm và trong cùng một độ dày màng, lượng thuốc hấp thụ vào các màng khác nhau là không giống nhau, tất cả sự sai khác này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Cụ thể:
31
− Trong cùng một loại màng: đối với màng CNM, sau 2h lượng thuốc hấp thụ được vào màng dày 0,3cm là 9,69mg nhiều hơn 1,1mg so với màng dày 0,5 cm; đối với màng Dừa dày 0,3cm hấp thụ được lượng thuốc nhiều hơn là 0.6mg so với màng Dừa dày 1cm; đối với màng Gạo thì lượng thuốc hấp thụ được vào màng dày 0,3cm là 0,75mg nhiều hơn 2mg so với màng dày 0.5cm.
− Trong cùng một độ dày màng 0,3cm: màng CNM hấp thụ được 9,69 mg thụốc sau 2h nhiều hơn 1,42mg so với lượng thuốc hấp thụ được vào màng Dừa và nhiều hơn 2,21mg so với lượng thuốc hấp thụ vào màng Gạo. Trong cùng một độ dày màng 0,5cm thì màng CNM hấp thụ thuốc được nhiều hơn so với màng Dừa và màng Gạo lần lượt là 0,91mg và 2,92mg.
− Trong cùng một loại màng và cùng một độ dày là 0,3cm:
Đối với màng CNM: màng sấy khô 100% lượng thuốc hấp thụ nhiều hơn so với màng sấy 50% và giữ nguyên lần lượt là 1,58mg và 2,57mg;
Đối với màng Dừa: màng sấy khô 100% lượng thuốc hấp thụ nhiều hơn so với màng sấy 50% và giữ nguyên lần lượt là 1,39mg và 2,14mg;
Đối với màng Gạo: màng sấy khô 100% lượng thuốc hấp thụ nhiều hơn so với màng sấy 50% và giữ nguyên lần lượt là 1,1mg và 2,33mg.
− Trong cùng một loại màng và cùng một độ dày là 0,5cm:
Đối với màng CNM: màng sấy khô 100% lượng thuốc hấp thụ nhiều hơn so với màng sấy 50% và giữ nguyên lần lượt là 1,5mg và 2,69mg.
Đối với màng Dừa: màng sấy khô 100% lượng thuốc hấp thụ nhiều hơn so với màng sấy 50% và giữ nguyên lần lượt là 1,54mg và 2,06mg.
Đối với màng Gạo: màng sấy khô 100% lượng thuốc hấp thụ nhiều hơn so với màng sấy 50% và giữ nguyên lần lượt là 0,91mg và 1,58mg.
Hiệu suất thuốc hấp thụ vào các màng cellulose vi khuẩn khác nhau với độ dày màng khác nhau trong 2h được thể hiện ở bảng 3.6
32
Bảng 3.6. Hiệu suất thuốc hấp thụ vào các loại màng cellulose vi khuẩn
khác nhau với độ dày màng khác nhau trong 2h
EE (%) Các loại
màng
Màng giữ nguyên Màng sấy 50% Màng sấy 100%
0,3cm 0,5cm 0,3cm 0,5cm 0,3cm 0,5cm Màng chuẩn 48,47 0,0057 42,94 0,0089 53,41 0,0029 48,87 0,0047 61.32 0,0048 56,19 0,0072 Màng dừa 41,36 0,0027 38,41 0,0098 45,12 0,0037 40,07 0,0037 52,04 0,0071 48,68 0,0052 Màng gạo 37,41 0,0022 33,66 0,0012 43,54 0,0075 37,02 0,0052 49,07 0,0042 41,56 0,0022
Qua bảng 3.6, ta có các biểu đồ sau:
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Màng CNM Màng dừa Màng gạo 0,3 cm 0,5 cm
Hình 3.13. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng cellulose vi khuẩn
33 0 10 20 30 40 50 60 Màng CNM Màng dừa Màng gạo 0,3 cm 0,5 cm
Hình 3.14. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng cellulose vi khuẩn
lên men từ 3 môi trường với thao tác sấy 50%
0 10 20 30 40 50 60 70 Màng CNM Màng dừa Màng gạo 0,3 cm 0,5 cm
Hình 3.15. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng cellulose vi khuẩn
34 0 10 20 30 40 50 60 70 Màng CNM Màng dừa Màng gạo Không sấy Sấy 50% Sấy 100% 0 10 20 30 40 50 60 Màng CNM Màng dừa Màng gạo Không sấy Sấy 50% Sấy 100%
Hình 3.16. Biểu đồ so sánh hiệu suất
hấp thụ của màng cellulose vi khuẩn lên men từ 3 môi trường với với độ dày 0,3 cm
Hình 3.17. Biểu đồ so sánh hiệu suất
hấp thụ của màng cellulose vi khuẩn lên men từ 3 môi trường với với độ dày 0,5 cm
Qua bảng 3.6, hình 3.13, 3.14, 3.15, 3.16, 3.17 chúng tôi nhận thấy: Trong cùng một màng thì hiệu suất thuốc hấp thụ ở độ dày màng 0,3cm lớn hơn màng 0,5 cm. điều này có thể giải thích là do màng 0,3 cm mỏng hơn, các sợi cellulose ít hơn nên thuốc có thể dễ dàng hấp thụ vào màng hơn.
Trong cùng một độ dày màng ta thấy màng CNM có hiệu suất thuốc hấp thụ được vào màng nhiều hơn so với màng Dừa và màng Gạo.
Trong cùng một loại màng thì hiệu suất hấp thụ của màng sấy khô đến khối lượng không đổi nhiều hơn so với màng sấy khô đến 50% và màng giữ nguyên.
Tất cả sự sai khác này đều có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Vì vậy, hiệu suất hấp thụ thuốc vào màng tỷ lệ thuận với khối lượng hấp thụ thuốc nên màng càng hấp thụ được nhiều thuốc thì hiệu suất càng lớn và ngược lại.
35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Sau khi hoàn thành xong khóa luận, chúng tôi đã thu được các kết quả như sau:
Nuôi cấy và thu được màng cellulose vi khuẩn từ A. xylinum trong một số môi trường.
Xử lý và đã thu được màng cellulose vi khuẩn tinh khiết với độ dày 0,3 cm và 0,5 cm. Màng cellulose vi khuẩn thu được tinh khiết, độ thoáng cao, không còn mùi chua, không bị biến tính khi sấy khô ở nhiệt độ cao, chất lượng phù hợp với nhu cầu làm thí nghiệm.
Màng CNM có khả năng hấp thụ thuốc cao hơn so với màng dừa và àng gạo
Màng cellulose vi khuẩn ở các độ dày 0,3 cm có khả năng hấp thụ thuốc cao hơn màng cellulose vi khuẩn có độ dày 0,5 cm.
Màng cellulose vi khuẩn sấy khô đến khối lượng không đổi có khả năng hấp thụ cao hơn màng cellulose vi khuẩn sấy khô đến 50% và màng cellulose vi khuẩn giữ nguyên trong cùng khoảng thời gian với cùng môi trường. Khả năng hấp thụ thuốc của màng cellulose vi khuẩn đạt cực đại tại 2 giờ.
2. Kiến nghị
Tiếp tục khảo sát khả năng hấp thụ thuốc cimetidine của màng cellulose vi khuẩn tạo bởi chủng A. xylinum từ các loại môi trường tự nhiên khác như: dịch hoa quả, nước chè xanh, nước mía, nước dứa,… để mở rộng nguồn nguyên liệu.
Tiếp tục nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc cimetidine của màng cellulose vi khuẩn chịu tác động ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau để thu được màng có khả năng hấp thụ thuốc tốt nhất nhằm cung cấp dữ liệu để phục