Hình 3. 26 Sản xuất lipase của chủng Bacillus sonorensis nhờ chất nền khô dầu mè
Mẫu sử dụng ở đây là ngao biển (Paphia malabarica) được thu thập từ các cửa sông Kalbadevi, ở Mumbai.
Trong phòng thí nghiệm các mẫu được rửa sạch bằng nước để loại bỏ bùn và dùng ethanol 80% để khử trùng bề mặt. Trong điều kiện vô trùng, lớp vỏ nghêu được tách ra và phần thịt mềm bên trong được đồng nhất với 10 ml nước biển vô trùng, sau đó pha loãng với 90 ml nước biển vô trùng trong bình nón. Bình được lắc trong khoảng 5 phút ở 150 rpm.
Phân lập, xác định và lựa chọn chủng vi khuẩn
Các phân tích vi sinh đối với mẫu ngao biển cho thấy có 11 chủng vi khuẩn có thể được phân lập
Vi khuẩn được xác định phần lớn dựa trên các hợp chất hữu cơ mà nó có thể phân hủy. Hợp chất hữu cơ bị phân hủy nhiều hay ít phụ thuộc vào lượng enzyme mà vi khuẩn có thể tạo ra. Spirit blue agar là môi trường cung cấp lipid – nguồn năng lượng cho vi khuẩn phát triển. Để sử dụng lipid, vi khuẩn phải sản sinh ra enzyme lipase để phân hủy lipid. Điều này cho phép xác định sự hiện diện của enzyme lipase. Spirit blue agar có màu xanh sáng, hơi đục sẽ trở nên trắng, trong hơn quanh vùng vi khuẩn sản xuất enzyme lipase [31].
Cách thực hiện:
Bước 1: Phân lập 11 chủng vi khuẩn riêng biệt
Bước 2: Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng bao gồm 15g peptone, 2.5g chiết xuất nấm men, 0.15g CaCO3, bổ sung tributyrin [1% v / v], 20g thạch vi khuẩn với 1L với nước biển, điều chỉnh pH lên 7.4. Môi trường được đổ vào đĩa petri.
Bước 3: Dùng các loopful (vòng nhỏ với kích thước xác định) tương tự nhau đặt vào môi trường dinh dưỡng. Trong mỗi loopful ta cấy mỗi chủng vi khuẩn rồi đem ủ ở 40°C trong 72 giờ.
Bước 4: Quan sát, đo đạc vùng tributyrin bị thủy phân xung quanh mỗi chủng vi khuẩn. Từ đó lựa chọn ra 4 chủng có vùng thủy phân rộng hơn trong 11 chủng.
Bước 5: Ngoài enzyme lipase xúc tác thủy phân tributyrin, các enzyme khác thuộc lớp lipase cũng có thể xúc tác thủy phân tributyrin. Do đó để có thể chọn chính xác 1 chủng vi khuẩn từ 4 chủng được chọn phía trên xem chủng nào sản sinh ra nhiều enzyme lipase nhất, ta đo khả năng sử dụng các chuỗi acid béo mạch dài của dầu olive trong môi trường Spirit blue agar
Bước 6: Sau nhiều kết quả đo đạc ở trên, tiếp đến ta sử dụng phương pháp 16s rRNA để định danh chủng tốt nhất trong 4 chủng. Kết quả cho thấy chủng tốt nhất được chọn là Bacillus sonorensis
Cấy chủng được chọn để sản xuất lipase
Bước 1: một loopful chứa các tế bào mới phát triển của chủng Bacillus sonorensis được chuyển từ môi trường agar tributyrin vào bình nón 250 ml chứa 100 ml chất dinh dưỡng bao gồm 3g peptone, 2g chiết xuất nấm men, 1,5% v/v dầu ô liu, 80% nước biển và đem đi ủ ở 40°C trong bể lắc điều nhiệt (150 rpm) trong 48 giờ.
Bước 2: 1 ml chủng (4.67 x 108CFU/ml) được cấy vào môi trường vô trùng có chứa khô dầu mè cho lên men để nghiên cứu tìm ra thông số tăng trưởng tối ưu
Hình 3. 27 Bể lắc điều nhiệt (water bath shaker),
https://dir.indiamart.com/impcat/water-bath-shaker.html
Tối ưu hóa các thông số sản xuất lipase trong quá trình lên men chìm sử dụng khô dầu mè
Tối ưu hóa cho các thông số sản xuất lipase được thực hiện thông qua sửa đổi một số thông số tăng trưởng. Thông số tối ưu để thu được nhiều lipase nhất là pH (dao động 3.0-11.0), nhiệt độ (20-80ºC), nồng độ chất nền (1-6%) và thời
100 kg khô dầu mè Nghiền Phối trộn 1 1 lít H3PO4 80 lít H2O Phối trộn 2 1 kg lân EM2 Phối trộn 3 1 kg papain Thành phẩm
Thử nghiệm hoạt tính enzyme
Sau khi lên men, các dung dịch chứa canh được ly tâm ở tốc độ 6.000 vòng/phút ở 4°C trong 20 phút để loại cặn thu dịch trong suốt. Dịch trong này được sử dụng như là mẫu lipase thô. Hoạt tính lipase được khảo sát bằng cách sử dụng phương pháp định lượng được mô tả bởi Watanbe et al. (1977). Phương pháp này sử dụng hệ nhũ tương polyvinyl alcohol và Olive oil (3: 1) để làm chất nền enzyme. Hoạt tính của enzyme được thể hiện dưới dạng đơn vị U/ml và nó được định nghĩa là số mols axit béo tự do giải phóng trên một ml lipase thô trên mỗi phút trong điều kiện khảo nghiệm.