3. Nội dung nghiên cứu
2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Để tách chiết được DNA tổng số, chúng tôi sử dụng lá của hai giống sắn nghiên cứu. Tách chiết DNA tổng số bằng dung dịch đệm chứa CTAB là phương pháp được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền thực vật. Dựa trên quy trình chuẩn của Saghai và Maroof (1994), nhiều quy trình tách chiết được xây dựng cho từng đối tượng thực vật. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng quy trình tách chiết DNA tổng số như sau:
(1) Các lá được lựa chọn sẽ được rửa sạch bụi, xịt qua cồn ethanol 70% sau đó để khô trong không khí và cho mẫu lá mỗi giống vào riêng túi sạch, buộc kín, ghi tên giống, giữ mẫu trong tủ âm 85oC ít nhất 2h.
(2) Nghiền 0.8 g mô lá sắn trong cối chày sứ thành dạng bột mịn. Bổ sung 6ml đệm rửa (Tris-HCl 100mM pH8; EDTA 5mM pH8; NaH2PO4 0.4%; sorbitol
350mM; H2O), nghiền tiếp đến khi trở thành dung dịch đồng nhất. Chia hỗn hợp vào các ống eppendorf 2ml, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.
(3) Loại dịch thu tủa, bổ sung đệm rửa, tiếp tục ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Quá trình được lặp lại từ 2 – 3 lần, loại dịch thu tủa.
(4) Bổ sung hóa chất CTAB 4% vào mỗi ống eppendorf . Ủ trong bể ổn nhiệt 65°C, trong vòng 60’ (5-10’ đảo một lần).
(5) Bổ sung chlorofom tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ 20’.
(6) Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15’ ở 4°C. Thu pha trên sang ống eppendorf 1.5 ml mới, tủa DNA bằng cồn isopropanol tỷ lệ 1:1 trong tủ âm 20°C ít nhất 2h. Ly tâm 12000 vòng/phút, 15’, 4°C, đổ dịch.
(7) Rửa tủa bằng cồn 70°: bổ sung 500µl cồn 70o, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15’ ở 4°C, loại dịch thu tủa. Lặp lại 2 – 3 lần.
(8) Làm khô tủa ở trong box cấy và hòa tan trong 50µl nước khử ion, bảo quản mẫu DNA ở -20oC.
(9) Điện di gel agarose 1% kiểm tra.