3. Nội dung nghiên cứu
1.3.2. Tình hình nghiên cứu gen CYP79D1 và CYP79D2
Trong số các gen thuộc họ CYP79, cả CYP79D1 và CYP79D2 đều có trong hệ gen của cây sắn và chịu trách nhiệm sản xuất glycosides cyanogenic. Quá trình tổng hợp độc tố trong sắn được quy định bởi nhiều gen, bước đầu là hai gen
CYP79D1 và CYP79D2, chúng được phát hiện trong lá mầm, cánh hoa ở đầu chồi cây sắn 2 tháng tuổi và hầu hết các mô, nhưng chủ yếu ở lớp vỏ ngoài, các lớp tế bào trụ bì (pericycle), các mô mạch (xylem, phloem) trong cuống [11], [14]. Quá trình chuyển hóa được thể hiện bằng sơ đồ:
Do đó, có thể dùng các cấu trúc antisense ngăn chặn hoặc làm giảm quá trình tổng hợp glycoside cyanogenic trong cây sắn [15].
Cytochrome P450s là các hemoprotein liên quan đến quá trình oxy hóa các hợp chất khác nhau. P450 ở sinh vật nhân sơ chủ yếu là protein hòa tan. Ở sinh vật nhân thực, P450 chủ yếu được tìm thấy trong mạng lưới nội chất (microsome). Cytochrome P450 có trong thành phần của cây sắn, xúc tác cho sinh tổng hợp hai dạng cyanogenic glycoside thông qua chuyển đổi L - valin và
L - isoleucine thành các dạng trung gian tương ứng là methyl propanal, methyl butanal oxime; acetone cyanohydrin, 2 - hydroxyl - 2 - methylbutyronitrile.
Năm 1996, chuyển gen ở sắn được thực hiện nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Từ đó đến nay, đã có nhiều bài báo về chuyển gen ở sắn được công bố. Trong những năm gần đây có một số báo cáo về chuyển gen mang các đặc tính nông học như tăng cường sức chống chịu, tăng hàm lượng tinh bột, chất dinh dưỡng vào cây sắn được công bố. Năm 2003, Siritunga và Sayre lần đầu tiên chuyển cấu trúc CYP79D1 và CYP79D2 vào sắn để ngăn chặn sự biểu hiện của cytochrome P450s trong quá trình tổng hợp glycoside cyanogenic. Các cây chuyển gen có hàm lượng cyanogen ít hơn 1% so với những cây sắn bình thường [17].
Năm 2005, hai cấu trúc sợi đối mã có tiềm năng giảm hàm lượng cyanide được sử dụng để tạo lượng lớn các dòng sắn là AS17A (tác động đến gen
CYP79D1) và AS17B (tác động đến gen CYP79D2), thu được kết quả là giảm 80% hàm lượng trong lá mầm, trong củ, hàm lượng cũng giảm 60%. Để giảm được nhiều hơn hàm lượng cyanide, công nghệ RNAi được thử nghiệm tác động ngăn chặn sự biểu hiện của hai gen CYP79D1 và CYP79D2, thí nghiệm trên 180 dòng có đã được kiểm chứng ở thí nghiệm trước có khả năng giảm xuống dưới 1% so với loài hoang dại ở lá mầm. 90 dòng được trồng trong 6 tháng để hình thành củ, hàm lượng đã giảm xuống duới 1% so với kiểu hình hoang dại. 40 dòng được nhận thấy hàm lượng linamarin trong củ giảm còn 8% ở loài hoang dã; 6 dòng độc lập hàm lượng linamarin thấp hơn 35% loài hoang dại [11].
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Giống sắn KM94 là con lai của tổ hợp lai R1 x R90, chung nguồn gốc cha mẹ với KU50 của Thái Lan. Giống sắn KM94 được Bộ Nông nghiệp và PTNT công nhận giống quốc gia năm 1995, là giống sắn công nghiệp được trồng phổ biến nhất ở Việt Nam hiện nay với quy mô trồng năm 2008 đạt 420.000 ha [12]. Đề tài nghiên cứu sử dụng hai giống sắn KM94 và sắn xanh Vĩnh Phú do trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cung cấp, được trồng tại vườn thực nghiệm Khoa Sinh học - Đại học Sư Phạm Thái Nguyên.
Các mẫu lá sắn non, sạch bệnh sau khi thu hái, được lau sạch với cồn và nước cất, bảo quản trong tủ ở -85oC.
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen, phòng thí nghiệm Thiết bị chung - Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.2. Thiết bị và hóa chất
Ống eppendorf, pipetman, máy li tâm Eppendorf centrifuge 5430R, máy PCR Eppendorf vapo.protect (Eppendorf, Đức).
Bể ổn nhiệt lab.companion RW 0525G (Lab Companion, Hàn Quốc). Tủ âm 20 Panasonic MDF-U334PE (Panasonic, Nhật).
Tủ âm 85 NUAIRE -85 Ultralow Freeze (Nuaire, Mỹ). Máy soi DNA UV.MS Major science (Major SCI, Mỹ). Lò vi sóng Electrolux (Việt Nam).
Tủ ấm Carbolite (Carbolite, Anh).
Nồi khử trùng Tomy SS325 (Tomy, Nhật).
Bộ điện di DNA Cleaver Scientific, Anh.
Hóa chất: các hóa chất thông dụng như: Tris, EDTA, phenol, ethanol (100%), RNase, agarose…được mua từ các hãng nổi tiếng Sigma, Invitrogen, Thermo Scientific…
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Hai giống sắn nghiên cứu được trồng và tiến hành thu mẫu để làm thí nghiệm. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng quy trình tách chiết RNA tổng số bằng kit như sau:
(1) Nghiền 30mg mô lá trong nitơ lỏng. Chuyển 300µl dung dịch chiết vào ống eppendorf 1,5 ml, bổ sung β-mercaptoethanol. Vortex trong 10 giây.
(2) Bổ sung 600μl proteinase, trộn đều và ủ ở 15-25°C trong 10 phút. (3) Li tâm 12000 vòng/phút trong 5-10 phút. Thu dịch sang ống eppendorf mới.
(4) Bổ sung 450 µl ethanol (96-100%) và trộn đều.
(5) Chuyển 700 μl dung dịch vào cột GeneJET RNA. Li tâm cột 12000 vòng/phút trong 1 phút. Thu cặn.
(6) Chuyển cột GeneJET RNA vào ống eppendorf 2ml mới.
(7) Bổ sung 700 μl dung dịch đệm 1 vào cột GeneJET RNA và li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch và đặt cột tinh lọc trở lại ống thu.
(8) Bổ sung 600 μl dung dịch đệm 2 vào cột GeneJET RNA và li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch và đặt cột tinh lọc trở lại ống thu.
(9) Bổ sung 250 μl dung dịch đệm 2 vào cột GeneJET RNA và li tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút. Chuyển cột GeneJET RNA sang ống eppendorf 1,5ml mới vô trùng.
(10) Bổ sung 100 μl nước vào giữa màng lọc. Li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột, sử dụng trực tiếp RNA thu được hoặc lưu trữ RNA ở -20°C cho đến khi sử dụng.
2.3.2. Phương pháp tạo cDNA
Từ RNA tổng số của hai mẫu sắn, cDNA được tổng hợp theo các bước (1) Bổ sung hóa chất vào ống eppendorf đã được khử trùng với tỉ lệ như sau: Template RNA: 0,1 μg - 5 μg
Primer Oligo (dT)18: 1 μl Nước: 12 μl
(2) Ủ ở nhiệt độ 65oC trong 5 phút sau đó chuyển sang đá lạnh.
(3) Bổ sung tiếp các thành phần: 5X reaction Buffer: 4 μl
RiboLock Rnase Inhibitor: 1 μl 10 mM dNTP Mix: 2 μl
Revertaid M-MuLV RT: 1μl Đảo đều và li tâm nhanh.
(4) Bổ sung mồi hexamer, đặt vào máy PCR theo chu trình nhiệt 25°C trong 5 phút, 42°C trong 60 phút và 70oC trong 5 phút.
Sản phẩm được lưu giữ ở -20oC.
2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Để tách chiết được DNA tổng số, chúng tôi sử dụng lá của hai giống sắn nghiên cứu. Tách chiết DNA tổng số bằng dung dịch đệm chứa CTAB là phương pháp được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền thực vật. Dựa trên quy trình chuẩn của Saghai và Maroof (1994), nhiều quy trình tách chiết được xây dựng cho từng đối tượng thực vật. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng quy trình tách chiết DNA tổng số như sau:
(1) Các lá được lựa chọn sẽ được rửa sạch bụi, xịt qua cồn ethanol 70% sau đó để khô trong không khí và cho mẫu lá mỗi giống vào riêng túi sạch, buộc kín, ghi tên giống, giữ mẫu trong tủ âm 85oC ít nhất 2h.
(2) Nghiền 0.8 g mô lá sắn trong cối chày sứ thành dạng bột mịn. Bổ sung 6ml đệm rửa (Tris-HCl 100mM pH8; EDTA 5mM pH8; NaH2PO4 0.4%; sorbitol
350mM; H2O), nghiền tiếp đến khi trở thành dung dịch đồng nhất. Chia hỗn hợp vào các ống eppendorf 2ml, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.
(3) Loại dịch thu tủa, bổ sung đệm rửa, tiếp tục ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Quá trình được lặp lại từ 2 – 3 lần, loại dịch thu tủa.
(4) Bổ sung hóa chất CTAB 4% vào mỗi ống eppendorf . Ủ trong bể ổn nhiệt 65°C, trong vòng 60’ (5-10’ đảo một lần).
(5) Bổ sung chlorofom tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ 20’.
(6) Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15’ ở 4°C. Thu pha trên sang ống eppendorf 1.5 ml mới, tủa DNA bằng cồn isopropanol tỷ lệ 1:1 trong tủ âm 20°C ít nhất 2h. Ly tâm 12000 vòng/phút, 15’, 4°C, đổ dịch.
(7) Rửa tủa bằng cồn 70°: bổ sung 500µl cồn 70o, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15’ ở 4°C, loại dịch thu tủa. Lặp lại 2 – 3 lần.
(8) Làm khô tủa ở trong box cấy và hòa tan trong 50µl nước khử ion, bảo quản mẫu DNA ở -20oC.
(9) Điện di gel agarose 1% kiểm tra.
2.3.4. Phương pháp PCR
Đoạn gen CYP79D1 được khuyếch đại bằng cặp mồi ME. Cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen CYP79D1 có mã số AF140613 và trình tự như sau:
ME-F: 5’-CAAGAGATACTTCGGCAAGG-3’ ME-R: 5’-ACCATGTCTTTGGGTTCCTG-3’ Nồng độ các thành phần và chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Nồng độ Hàm lượng
1 Nước khử ion 6 µl
2 GoTaq Green Master Mix 2X 7,5 µl
3 ME – F 10pmol/µl 0,5µl
5 cDNA khuôn 10 - 20 ng/µl 0,5µl
Tổng thể tích 15µl
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 4 phút 1
2 Biến tính 94 40 giây
35
3 Gắn mồi 59 40 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 40 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc 4 ∞
Sản phẩm được lưu trữ ở 4 oC.
2.3.5. Phương pháp điện di sản phẩm PCR
Điện di sản phẩm PCR khoảng 30 phút trên gel agarose 1% ở 110V trong dung dịch đệm TAE 1X. Gel sau khi điện di được nhuộm với ethidium bromide nồng độ 0,5mg/ml trong 5 phút, rửa sạch, sau đó soi dưới đèn UV có bước sóng 320 nm và chụp ảnh.
2.3.6. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification gồm các bước sau:
(1) Bổ sung Binding buffer vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ 1 : 1 về thể tích. (2) Chuyển sang cột lọc, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút ở 4oC, loại bỏ dịch.
(3) Bổ sung 700 µl Washing buffer, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. (4) Chuyển cột lọc sang ống eppendort 1,5 ml, mở nắp 3 phút cho bay cồn. (5) Bổ sung 25µl nước khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch đáy.
(6) Sản phẩm tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Bảo quản sản phẩm trong tủ -20oC.
2.3.7. Phương pháp đọc trình tự
Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, trình tự đoạn gen CYP79D1 được xác định trên thiết bị giải trình tự nucleotide tự động ABIPRISM@3100 Genetic Analyzer (Applied Biosytem) tại Viện Công nghệ Sinh học.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết RNA, tạo cDNA và nhân đoạn gen CYP97D1
Mẫu sắn sau khi thu thập được tiến hành tách chiết RNA tổng số bằng kit được mô tả ở phần 2.3.1 - Chương 2.
Hình 3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số KM94: sắn KM94; XVP: sắn Xanh Vĩnh Phú
Kết quả tách chiết RNA tổng số cho thấy mẫu RNA đạt hiệu suất và độ tinh sạch cao.
Sau khi tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA, quá trình nhân bản đoạn gen mã hóa CYP79D1 được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu ME-F và ME-R. Thành phần và chu trình nhiệt như trình bày trong phần 2.3.3. Chương 2.
Hình 3.2. Kết quả PCR nhân đoạn gen CYP79D1 từ RNA tổng số 1-5: sắn KM94; 6-10: sắn Xanh Vĩnh Phú; M: Marker 1kb
Trên điện di đồ (hình 3.2) cho thấy sản phẩm PCR ở các mẫu sắn đều có kích thước khoảng 0,5kb. Kích thước này hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và không có sản phẩm phụ.
3.2. Kết quả tách chiết DNA và nhân đoạn gen CYP97D1
Song song với quá trình nhân bản đoạn gen CYP79D1 từ RNA tổng số, chúng tôi còn tiến hành nhân bản đoạn gen CYP79D1 từ DNA tổng số. DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp được mô tả trong phần 2.3.1 - Chương 2.
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số 1. Sắn KM94 2. Sắn xanh Vĩnh Phú
Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy ở cả 2 mẫu đều xuất hiện 1 băng sáng, rõ chứng tỏ chúng tôi đã tách được DNA tổng số của các giống sắn với độ nguyên vẹn đảm bảo cho nhân bản đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR tiếp theo (Hình 3.3).
Sau khi tách chiết thành công DNA tổng số, quá trình nhân bản đoạn gen mã hóa CYP79D1 được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu ME-F và ME-R. Thành phần và chu trình nhiệt như trình bày trong phần 2.3.3 Chương 2.
Hình 3.4. Kết quả PCR nhân đoạn gen CYP79D1
Trên điện di đồ (Hình 3.4) cho thấy sản phẩm PCR ở các mẫu sắn đều có kích thước khoảng 1 kb. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và không có sản phẩm phụ.
3.3. Xác định và phân tích trình tự đoạn gen CYP79D1 của 2 giống sắn Xanh Vĩnh Phú và KM94
Do sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất như mồi, đệm PCR, các nucleotide...còn dư và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình xác định trình tự nucleotide. Chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR của 2 mẫu sắn theo Kit GenJET DNA Purification. Các đoạn gen sau khi tinh sạch được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra chất lượng và giải trình tự gen.
Xác định trình tự nucleotide
Sau khi giải trình tự, các đoạn gen CYP79D1 được xử lý bằng chương trình BLAST trên NCBI và phần mềm BioEdit. Các trình tự đoạn gen CYP79D1 của giống sắn xanh Vĩnh Phú và giống sắn KM-94 được chúng tôi so sánh với trình tự gen CYP79D1 có mã số AF140613 trên GenBank.
Sau khi xác định trình tự nucleotide và phân tích bằng các phần mềm, kết quả cho thấy đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú được tách chiết từ RNA đều có kích thước là 669 bp, gen CYP79D1 được tách chiết từ DNA có kích thước là 999 bp. Tiếp theo, chúng tôi so sánh trình tự gen
CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú với trình tự gen AF140613.
So sánh trình tự đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú với trình tự có mã số AF140613 trên Genbank
Trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613 có kích thước là 1629 bp. Trình tự gen AF140613 phân lập từ cDNA do vậy trình tự gen này chỉ gồm các đoạn exon. Kết quả so sánh cho thấy, các đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94
và giống sắn xanh Vĩnh Phú có mức độ tương đồng với gen AF140613 là 99%. Cặp mồi mà chúng tôi thiết kế để nhân bản đoạn gen CYP79D1 nằm từ nucleotide 674 tới nucleotide 1342 của trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613. Đây là vùng bảo thủ trong họ gen này đảm bảo cho quá trình làm câm lặng gen sau này. Khi so sánh về trình tự nucleotide đoạn gen CYP79D1 của 2 giống Sắn Xanh Vĩnh Phú và sắn KM94 được tách từ DNA với gen có mã số AF140613 chúng tôi nhận thấy có sự khác nhau ở vị trí nucleotide thứ 100 (từ nucleotide G thành nucleotide A). Tuy nhiên trong đoạn trình tự chúng tôi có 2 vùng exon và xen kẽ là 1 vùng intron, vùng intron nằm ở vị trí từ 345 đến 675. Do vậy sự tương đồng giữa 2 đoạn gen này với gen có mã số AF140613 chia làm 2 vùng như mô tả hình 3.5.
Hình 3.5. So sánh bằng đồ họa về trình tự đoạn gen CYP79D1
Khi so sánh trình tự nucleotide được phân lập từ RNA tổng số với trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613 trên Genbank cho thấy các đoạn gen CYP79D1
của giống sắn KM-94 và giống sắn xanh Vĩnh Phú có mức độ tương đồng là 99%, giữa các trình tự có sự khác nhau ở vị trí nucleotide thứ 100 (từ nucleotide G thành nucleotide A) và ở vị trí nucleotide thứ 130 (từ nuceotide G thành nuceotide A).
Khi so sánh trình tự nucleotide được phân lập từ DNA với trình tự nucleotide được phân lập từ RNA tổng số chúng tôi nhận thấy có sự khác nhau: