Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong EtOH (500ml), hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu cho đến tan. Dung dịch đƣợc lọc nóng để lọai bỏ các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc đƣợc làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) † (-20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể đƣợc lọc và hút khô thu đƣợc sản phẩm metformin hydrochloride 18g. Dịch lọc EtOH tiếp tục đƣợc kết tinh lại sản phẩm lần thứ 2 lặp lại theo qui trình nhƣ trên thu thêm đƣợc 6g sản phẩm. Tổng hai lần kết tinh thu đƣợc là 24g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 48%.
Nhƣ vậy, dung môi MeOH phù hợp để kết tinh sản phẩm metformin hydrocholoride. Sản phẩm metformin hydrochloride đƣợc kết tinh lại trong MeOH 3 lần nhận đƣợc sản phẩm có độ sạch 99,8% ( đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp HPLC-MS).
2.3.2.Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride.
Liều độc LD50 đƣợc nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
2.3.2.1. Đối tƣơ ̣ng nghiên cứu
* Thuốc thử: chất metformin hydrochloride ở da ̣ng bô ̣t trắng , hòa tan trong nƣớc cất.
* Động vâ ̣t thƣ̣c nghiê ̣m:
Chuô ̣t nhắt trắng , cả hai giống , khỏe mạnh , trọng lƣợng từ 18–22g do Viê ̣n Vê ̣ sinh di ̣ch tễ Trung ƣơng cung cấp.
Chuô ̣t đƣợc nuôi trong phòng thí nghiê ̣m 3 ngày trƣớc khi nghiên cứu , đƣợc nuôi bằng thƣ́c ăn chuẩ n do Viê ̣n Vê ̣ sinh di ̣ch tễ Trung ƣơng sản xuất , uống nƣớc tƣ̣ do.
Chuô ̣t đƣợc cân để xác đi ̣nh tro ̣ng lƣợng và đƣợc phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con.
2.3.2.2. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u
Xác định LD50 của metformin hydrochloride trên chuột nhắt trắng bằng đƣờng uống theo phƣơng pháp Litchfield – Wilcoxon .Trƣớc khi tiến hành thí nghiê ̣m, cho chuô ̣t nhi ̣n ăn qua đêm. Tƣ̀ng lô chuô ̣t nhắt đƣợc uống thuốc thƣ̉ theo liều tăng dần tƣ̀ 900mg/kg thể tro ̣ng đến 2100mg/kg thể tro ̣ng, uống 3 lần trong 24 giờ, mỗi lần uống cách nhau ít nhất 2 giờ.
Theo dõi tình tra ̣ng chung của chuô ̣t và số lƣợng chuô ̣t chết ở mỗi lô trong 72 giờ. Sau đó tiếp tu ̣c theo dõi tình tra ̣ng chung của chuô ̣t đến hết ngày thƣ́ 7.
2.3.2.3. Kết quả nghiên cứu.
Kết quả nghiên cƣ́u cho thấy, sau khi uống thuốc, ở những lô dùng thuốc với liều thấp dƣới 900mg/kg thể tro ̣ng, chuô ̣t có giảm hoa ̣t đô ̣ng, run nhƣng sau khoảng 30 phút lại ăn uống và hoạt động bình thƣ ờng, đi ngoài phân khô . Ở nhƣ̃ng lô chuô ̣t uống thuốc thƣ̉ liều cao, chuô ̣t giảm vâ ̣n đô ̣ng, run rõ rê ̣t, tai và đuôi tím tái, phân nhão. Tƣ̀ liều 1100mg/kg trở lên có chuô ̣t chết trong vòng 72 giờ. Số lƣợng chuô ̣t chết trong vòng 72 giờ đƣợc trình bày trên bảng 2.1.
Bảng 2.1. Kết quả thƣ̉ đô ̣c tính cấp của metformine hydrochloride
Tƣ̀ bảng kết quả trên,ta xây dƣ̣ng đồ thi ̣ về mối tƣơng quan giƣ̃a liều dùng và số chuột chết đƣợc biểu diễn trên hình 2.1.
Hình 2. 1.Biểu đồ về mối tƣơng quan giƣ̃a liều dùng và số chuô ̣t chết Với R2 = 0,9776 đã cho thấy hai đa ̣i lƣợng này có mối tƣơng quan rất chă ̣t chẽ, do đó ta có thể sƣ̉ du ̣ng phƣơng trình y = 0,0088x – 8,5536 để tính đƣợc LD50 =1540mg/kg.
Nhƣ vậy ta có thể đi đến kết luâ ̣n:
LD50 của metformine hydrochloride là: 1540mg/kg
2.3.3.Nghiên cứu hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC-MS)
STT Liều dùng
(mg/kg) Số chuô ̣t/lô Số chuô ̣t chết Tỷ lệ %
1 900 10 0 0 2 1100 10 1 10 3 1300 10 2 20 4 1500 10 4 40 5 1700 10 7 70 6 1900 10 8 80 7 2100 10 10 100 Liều dùng(mg/kg) Số chuô ̣t chết
Xây dựng đƣờng chuẩn metformine hydrochloride: Cân 2mg metformin hydrochloride chuẩn đƣợc pha loãng trong MeOH với các nồng độ nhƣ sau: 2mg/ml, 0.4mg/ml, 0.2mg/ml, 0.1mg/ml.
Điều kiện và thiết bị phân tích: Sử dụng hệ thiết bị HPLC Agilent 1100, Detector DAD, bƣớc sóng 254nm. Pha động H2O:MeOH= 35:65. Hệ Pha động đƣợc cài đặt nhƣ sau:
Xây dựng đƣờng chuẩn: Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên phần mềm excel.
Time(min) %B (MeOH) Flow (ml/min)
0,00 65 0,01
4,00 65 0,01
5,00 65 0,3
30 65 0,3
Nồng Độ(mg/ml) Diện tích Pic
2 5393,66
0,4 1027,07
0,2 515,55
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 2000 4000 6000 Dtich n o n g d o (m g /m l) nongdo(mg/ml) Predicted nongdo(mg/ml) Phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y= 0.000372*X
Trong đó: Y là Nồng độ metformin hydrochloride (mg/ml); X là diện tích pic metformin hydrochloride .
Xác định nồng độ Metformine hydrochloride: Cân 0.8mg chất cần phân tích, hòa tan trong 1ml MeOH. Kết quả đo diện tích pic (X)= 2115,1. Thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn ta đƣợc Y= 0.8mg/ml.
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tổng hợp Glibenclamid.
Cho axit 5-chloro-2- methoxybenzoic (1) phản ứng với SOCl2 trong sự có mặt của dung môi CHCl3 ở 250C, trong khoảng 8h nhận đƣợc 5-chloro-2- methoxybenzoyl chloride (2) với hiệu suất 85,71%. Chất trung gian (2) đƣợc ngƣng tụ với 4-(2-aminoethyl)benzenesulfonamit (3) trong môi trƣờng pyridin ở nhiệt độ 600C trong khoảng 8h tạo thành (4) với hiệu suất 90%. Chất trung gian (4) cho tác dụng với cyclohexyl isocyanat trong môi trƣờng kiềm Na2CO3 dung môi aceton, ở 250C trong khoảng 36h tạo thành hợp chất
5 với hiệu suất đạt đƣợc 82,11%.( Sơ đồ 3.1).
Sơ đồ 3.1. Tổng hợp glibenclamide.
Nhƣ vậy, glibenclamit đã đƣợc nghiên cứu tổng hợp qua ba bƣớc phản ứng từ axit 5-chloro-2-methoxybenzoic. Tất cả các bƣớc phản ứng đều đạt
Cấu trúc của sản phẩm đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H và 13C-NMR, phổ khối lƣợng EI-MS.
Hình 3.1: Phổ 1H-NMR của chất trung gian (4).
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 4 xuất hiện đầy đủ các tín hiệu đặc trƣng cho độ chuyển dịch hóa học của các proton có mặt trong phân tử. Tín hiệu ở δH 8,25 ppm (1H, m,) đặc trƣng cho proton nhóm NH, tín hiệu δH 7,28 ppm (2H, bs,) đặc trƣng cho proton nhóm NH2;, tín hiêu δH 3,81ppm (3H, s, OMe) đặc trƣng cho proton nhóm OMe. Trong phổ 1H- NMR của chất này còn xuất hiện các tín hiệu của proton H-9, H-10, H-12, H- 13, H-14, H-15, H-18, H-20, H-21 tại δH 7,76 (2H, d, J=8,5Hz, H-9 và H-13); 7,64 (1H, d, J=3Hz, H-18); 7,51-7,48 (1H, dd, J=3Hz và 9Hz, H-20); 7,45 (2H, d, J=8,5Hz, H-10 và 12); 7,16 (1H, d, J=9Hz, H-21); 3,55-3,51 (2H, m, H-15); 2,93-2,90 (2H, m, H-14)
Hình 3.2: : Phổ 13C-NMR của chất trung gian (4)
Phổ 13C-NMR của chất trung gian 4 khẳng định sự có mặt của 16 nguyên tử cacbon bao gồm hai nhóm cacbonyl CO tại δC (ppm) 163,56 (C-9) và 155,65 (C-15); 143); nguyên tử cacbon bậc 4 chƣa no tại δC 143,58 (C-4); 142,09 (C-1);6 nhóm metin olefinic ( =CH) tại δC 131,45 (C-13) ; 129,45 (C- 11); 129,12(C-3 và 5); 125,65 (C-2 và 6); 1 nhóm halogen ( C-Cl) tại δC 124,79 (C-12); 1 nhóm metoxi tại δC 56,23 (OMe); 2 nhóm metylen (CH2) tại δC 54,83 (C-8); 34,55 (C-7).
Phổ khối EI-MS cho pic ion giả phân tử 4 ở m/z 368 [M +H]+ (C16H17ClN2O4S ).
Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của chất glibenclamide (5).
Phổ 1H-NMR của 5 cho các tín hiệu cộng hƣởng từ proton ở δH (ppm) 7,93 (2H, d, J=8,5Hz, H-9 và 13); 7,83 (1H, s, H-18); 7,52 (2H, d, J=8Hz, H- 10 và 12); 7,47 (1H, d, J=9Hz, H-20); 7,11 (1H, d, J=9Hz, H-21); 3,85 (3H, s, OMe); 3,73-3,70 (2H, m, H-15); 3,43-3,42 (1H, m, H-1); 3,066-3,038 (2H, t, J=7Hz, H-14); 1,78-1,17 (10H, m, H-1, 2, 3, 4, 5, 6 vùng no).
Hình 3.4: : Phổ 13C-NMR của chất glibencalmide (5) .
Phổ 13C -NMR của glibenclamide khẳng định sự có mặt của 23 nguyên tử cacbon bao gồm 2 nhóm cacbonyl CO tại δC (ppm) 166,6 (C-7); 159,9 (C- 16); nguyên tử cacbon bậc 4 chƣa no tại δC 144,1 (C-11); 133,4 (C-8); 6 nhóm metin olefinic ( =CH) tại δC 131,5 (C-20); 129,9 (C-10 và 12); 128,1 (C-9, 13 và 18); 1 nhóm halogen ( C-Cl) tại δC 127,1 (C-19); 1 nhóm metoxi tại δC 57,1 (OCH3); 2 nhóm –CN tại δC 41,8 (C-1) và 36,0 (C-15); 5 nhóm metylen ( CH2) tại δC 34,7 (C-4); 26,7 (C-2);26,7 (C-6); 26 (C-3) và 25,9 (C-5).
Hình 3.5: Phổ EI-MS của glibenclamide (5).
Phổ khối EI-MS cho pic ion giả phân tử glibenclamide ở m/z 495 [M +H]+ (C23H28ClN3O5S).
3.2. Tổng hợpmetformine hydrochloride.
Tổng hợp metformine hydrochloride theo phƣơng pháp của Shapiro [3] (sơ đồ 3.2) trong điều kiện không dung môi. Từ 1 mol dicyano diamide và 1 mol dimethyl amine hydrochloride trộn lẫn với nhau đƣợc đun ở nhiệt độ: 140oC trong 6h. Hỗn hợp phản ứng sau đó đƣợc kết tinh trong dung môi metanol nhận đƣợc metformin hydrochloride với hiệu suất phản ứng là 70%.
Sơ đồ 3.2: Tổng hợp trực tiếp metformin hydrochloride
Hình 3.6: Phổ 1H-NMR của chất metformin hydrochloride.
mặt trong phân tử. Tín hiệu ở δH 2,91 ppm (6H, s,) đặc trƣng cho proton ở 2 nhóm CH3.
Hình 3.7: : Phổ 13C-NMR của chất metformin hydrochloride.
Trên phổ 13C-NMR xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hƣởng của 4 nguyên tử cacbon bao gồm 2 nhóm metyl ( CH3) tại δC (ppm) 37,4 ( C-1 và C-1‟ ); 2 nhóm amin C-NH2 tại δC (ppm) 160,0 (C-3), và 158,3 (C-2).
Phổ khối EI-MS cho pic ion giả phân tử glibenclamide ở m/z 129 [M- HCl]+ (C4H11N5.HCl).
3.2.1. Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride
Metformine hydrochloride đƣợc làm sạch bằng cách kết tinh trong các dung môi khác nhau: aceton, metanol, etanol.
Sản phẩm thô metformine hydrochloride (50g) lần lƣợt đƣợc hoàn tan trong các dung môi nóng aceton, MeOH và EtOH. Dung dịch đƣợc lọc nóng để loại bỏ các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc đƣợc kết tinh trong tủ lạnh 24h, lọc bỏ dung môi, hút khô nhận đƣợc tinh thể
metformine hydrochloride màu trắng với hiệu suất kết tinh trong aceton là 30%, trong MeOH là 82% và trong EtOH là 48%. Nhƣ vậy, metformine hydrochloride đƣợc kết tinh trong dung môi MeOH cho hiệu suất kết tinh đạt 82% và độ tinh khiết khoảng 99,8%.
3.2.2. Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride
Liều độc LD50 đƣợc nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Kết quả nghiê n cƣ́u cho thấy sau khi uống thuốc , ở những lô dùng thuốc với liều thấp dƣới 900mg/kg thể trọng, chuô ̣t có giảm hoa ̣t đô ̣ng, run nhƣng sau khoảng 30 phút lại ăn uống và hoạt động bình thƣờng , đi ngoài phân khô . Ở những lô chuột uống thuốc thƣ̉ liều cao, chuô ̣t giảm vâ ̣n đô ̣ng , run rõ rê ̣t , tai và đuôi tím tái , phân nhão. Tƣ̀ liều 1100mg/kg trở lên có chuô ̣t chết trong vòng 72 giờ. Số lƣợng chuô ̣t chết trong vòng 72 giờ đƣợc trình bày nhƣ bảng 3.1
Bảng 3.1:Bảngkết quả thử độc tính cấp của metformin hydrochloride
Từ bảng kết quả , xây dƣ̣ng đƣợc đồ thi ̣ về mối tƣơng quan giƣ̃a liều dùng và số chuột chết nhƣ sau:
LST
T Liều dùng (mg/kg) Số chuô ̣t/lô Số chuô ̣t chết Tỷ lệ %
1 900 10 0 0 2 1100 10 1 10 3 1300 10 2 20 4 1500 10 4 40 5 1700 10 7 70 6 1900 10 8 80 7 2100 10 10 100
Hình 3.8: Đồ thị về mối tƣơng quan giữa liều dung và số chuột chết Với R2 = 0,9776 đã cho thấy hai đa ̣i l ƣợng này có mối tƣơng quan tuyến tính, do đó ta có thể sƣ̉ du ̣ng phƣơng trình y = 0,0088x – 8,5536 để tính đƣợc LD50 = 1540mg/kg.
Nhƣ vật,độc tính cấp LD50 của metformine hydrochloride là: 1540mg/kg
3.2.3. Hàm lƣợng metformin hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC
Định lƣợng metformin hydrochloride bằng HPLC sử dụng hệ thiết bị HPLC Agilent 1100, Detector DAD, bƣớc sóng 254nm. Pha động H2O: MeOH= 35:65. Hệ Pha động đƣợc cài đặt nhƣ sau:
Time(min) %B (MeOH) Flow (ml/min)
0,00 65 0,01
4,00 65 0,01
5,00 65 0,3
30 65 0,3
Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên phần mềm excel nhƣ chỉ ra ở hình sau đây.
Liều (mg/kg)
Số chuô ̣t
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 2000 4000 6000 Dtich n o n g d o (m g /m l) nongdo(mg/ml) Predicted nongdo(mg/ml) Phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y= 0.000372*X
Trong đó: Y là Nồng độ metformin hydrochloride (mg/ml); X là diện tích pic metformin hydrochloride (mg/ml).
Xác định nồng độ Metformin: Cân 0,8mg chất cần phân tích, hòa tan trong 1ml MeOH. Kết quả đo diện tích pic (X)= 2115,1(mg/ml).Thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn ta đƣợc Y= 0,8mg/ml. Nhƣ vậy, mẫu phân tích chứa 100% metformin hydrochloride.
KẾT LUẬN
1.Đã nghiên cứu tổng hợp đƣợc glibenclamide từ axit 5-chloro-2- methoxybenzoic với hiệu suất là 82,11%.
2. Đã đánh giá đƣợc hàm lƣợng sản phẩm glibenclamide theo tiêu chuẩn dƣợc điển châu Âu với hiệu suất 99,95%
3.Đã nghiên cứu tổng hợp metfomine hydrochloride bằng phƣơng pháp của Shapiro:Ngƣng tụ trực tiếp dicyano diamide và dimetyl amine hydrochloride, kết quả cho thấy khi ngƣng tụ trực tiếp dicyano diamide và dimethyl amine ở nhiệt độ 1400C trong khoảng thời gian 6h nhận đƣợc metfomin hydrochloride với hiệu suất cao 70%.
4. Đã nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride trong các dung môi aceton, metanol, etanol. Kết quả cho thấy kết tinh trong metanol cho hiệu suất cao nhất 82%.
5. Đã tiến hành nghiên cứu xác định độc tính cấp LD50 của metformine hydrochloride, cho giá trị LD50= 1540mg/kg.
6.Đã phân tích đƣợc hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC kết quả cho thấy mẫu phân tích chứa 100% metformin hydrochloride.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Tạ Văn Bình, Hoàng Kim Ƣớc và cộng sự (2004), "Dịch tễ học bệnh đái tháo đường, các yếu tố nguy cơ và các vấn đề liên quan đến quản lý bệnh đái tháo đường tại khu vực nội thành 4 thành phố lớn năm 2001", Một số công trình nghiên cứu khoa học tiêu biểu của các dự án quốc gia thực hiện tại bệnh viện nội tiết 1969-2003, NXB Y Học,tr.173-199.
2. Tạ Văn Bình, Hoàng Kim Ƣớc và cộng sự (2004), "Kết quả điều tra đái tháo đường và rối loạn dung nạp đường huyết ở đối tượng có nguy cơ cao tại Phú Thọ, Sơn La, Thanh Hoá và Nam Định năm 2003"- Một số công trình nghiên cứu khoa học tiêu biểu của các dự án quốc gia thực hiện tại bệnh viện nội tiết 1969-2003, NXB Y Học,tr. 353-373.
3. Tạ Văn Bình, Stephen Colargiuri và cộng sự (2004), Phòng và quản lý bệnh đái tháo đường tại Việt Nam-Phần 2 , NXB Y Học,tr. 8-9, 12-13,17. 4.Đỗ Trung Đàm ( 1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc,
Nhà xuất bản Y học, Hà Nội .
5.Trƣơng Phƣơng và Ngô Quốc Huy (2006), “ Tạp chí Dƣợc học ”,tr. 264, 11-13.
6. Thái Hồng Quang (1997), Bệnh đái tháo đường, Bệnh nội tiết
, NXB Y Học,Hà Nội, tr. 257-358.
7. Lê Đình Sáng (2010),Y học cổ truyên, NXB Y Học,Hà Nội.
8.Nguyễn Đình Triệu (2006), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hóa học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
9. Mai Thế Trạch và cộng sự ( 1994), "Dịch tễ học và điều tra cơ bản về bệnh tiểu đường ở nội thành thành phố Hồ Chí Minh". Tạp chí Y Học, chuyên đề nội tiết học, Trường Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh,tr. 25-28.
10.Nguyễn Đình Thành (2011),Cơ sở phương pháp phổ ứng dụng trong hoá học,
11. Nguyễn Minh Thảo (2001), Tổng hợp hữu cơ, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội.
Tiếng Anh.
12.Alimova IN, Liu B, Fan Z, et al (2009), “ Metformin inhibits breast cancer cell growth, colony formation and induces cell cycle arrest in vitro’’ , Cell Cycle 26:8 .
13.Ashcroft SJH, Niki I, Kenna S, Weng L, Skeer L, Coles B, Ashcroft FM (1993), “ The -cell sulfonylurea receptor ‟‟, Adv Exp Med Biol. ; 334: 47- 61.
14. Barelli, Giulio; De, Regis Massimo (1997), “ A glibenclamide-metformin combination for the treatment of diabetes mellitus type II. PCT Int. Appl ‟‟ , 24 pp. CODEN: PIXXD2 WO 9717975 A1 19970522.
15.Bentefrit, F. và các cộng sự (1997) , “ J. Inorg. Biochem ’’, 68, 53-59. 16.Dipalma J. R (1971), “ Diabetes mellitus, Drill's pharmacology in medicine’’, McGraw-Hill, 1492-1525.
17.Gaines KL, Hamilton S, Boyd AE III.(1988) , „„ Characterization of the sulfonylurea receptor on beta cell membranes’’, J Biol Chem ;263: 2589–92. 18.Hokfelt B, Jonsson A (1988), “ Hypoglycemic activity in relation to chemical structure of potential oral antidiabetic substances ‟‟, I. 1-Sulfonyl- 3-alkylureas. J.
19.http://www.fda.gov/bbs/topics/ANSWERS/ANS00627.html "FDA Approves New Diabetes Drug "
20.Hadad SM, Appleyard V, Thompson AM (2009) “ Therapeutic metformin/AMPK activation promotes the angiogenic phenotype in the ERalpha negative MDA-MB-435 breast cancer model ‟‟ , Breast Cancer Res Treat 114:391.
21.Hadad SM, Fleming S, Thompson AM ,Targeting AMPK (2008), “ A new therapeutic opportunity in breast cancer ‟‟, Crit Rev Oncol Hematol 67:1–7 . 22.Kristiina, M. và các cộng sự (2009), “ J. Med. Chem’’, 52, 4142-4118. 23.Lara Ochoa, Jose Manuel Francisco; De la Torre Garcia, Juan Antonio; Franco Andrade, Fidencio ( publication date 25-01-2001), “ Improved process for the preparation of benzenesulfonylureas used as second- generation oral hypoglycemic agents’’, PCT patent W 0015354 (A2).
24.Meyer M, Chudziak F, Schwanstecher C, Schwanstecher M, Panten U