3.5.1 Xác định hoạt tính bắt gốc tự do DPPH
Phương pháp DPPH được xem là một trong những phương pháp so màu chuẩn và dễ dàng để đánh giá các đặc tính chống oxy hóa của các hợp chất chống oxy hóa. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc gốc tự do DPPH nhận nguyên tử hydro (H) của chất chống oxy hóa, dẫn đến giảm DPPH làm thay đổi màu sắc từ màu tím sang màu vàng [36].
Dung dịch gốc được pha chế bằng cách hòa tan 24 mg DPPH với 100 mL methanol và sau đó được bảo quản ở nhiệt độ 4ºC cho đến khi đạt được 48 giờ. Dung dịch thuốc thử được pha loãng bằng methanol về độ hấp thụ 1.10 ± 0.02 đơn vị ở 515 nm bằng máy đo quang phổ. Dung dịch phân tích (150 μL) được phản ứng với 2850 μL dung dịch DPPH trong 30 phút trong điều kiện tối. Sau đó, độ hấp thụ được thực hiện ở 515nm bằng máy đo quang phổ.
3.5.2 Xác định hoạt tính bắt gốc tự do ABTS
Trong phương pháp này, ABTS•+ bị oxy hóa bởi kali persulfate tạo thành cation gốc của nó (ABTS+) có màu xanh đậm. Khả năng bắt gốc tự do và khả năng chống oxy hóa của các hợp chất được đo bằng khả năng làm giảm màu của thuốc thử khi phản ứng trực tiếp với gốc ABTS. ABTS•+ được áp dụng cho cả hợp chất ưa béo và ưa nước [37].
Dung dịch ABTS•+ được pha loãng với methanol để thu được độ hấp thụ 1.10 ± 0.02 ở 734 nm. Dung dịch phân tích (150 μL) được phản ứng với 2850 μL thuốc thử ABTS trong 30 phút trong điều kiện tối. Sau đó, độ hấp thụ được thực hiện ở 734 nm bằng máy quang phổ.
3.5.3 Xác định hoạt tính khử sắt (FRAP)
Phương pháp FRAP đo khả năng của các chất chống oxy hóa khử phức hợp sắt 2,4,6-tripyridyl-s-triazine [Fe3+-(TPTZ)2]3+ thành phức chất màu có màu xanh đậm [Fe2+-(TPTZ)2]2+ trong môi trường acid [38].
Thuốc thử FRAP được điều chế như sau: dung dịch đệm acetate (300 mM, pH 3.6), dung dịch TPTZ được pha trong HCl (40 mM) và dung dịch FeCl3.6H2O (20 mM) được trộn theo tỷ lệ thể tích 10:1:1. Dịch phân tích (150 µL) được cho phản ứng với 2850 µL thuốc thử FRAP trong 30 phút trong bóng tối. Sau đó, độ hấp thu được đo ở bước sóng 593 nm.
3.5.4 Xác định hoạt tính khử đồng (CUPRAC)
Phương pháp CUPRAC dựa trên phép đo độ hấp thụ của Cu (I) - chocate neocuproine (Nc) được hình thành do phản ứng oxi hóa khử của các chất chống oxy hóa phá vỡ chuỗi bằng thuốc thử CUPRAC, Cu (II)-Nc, trong đó độ hấp thụ được ghi nhận tại bước sóng hấp thụ ánh sáng cực đại 450nm [39].
Dịch phân tích (0.5 mL) được thêm vào hỗn hợp phản ứng có chứa CuCl2 (1 mL, 10 mM), neocuproine (1 mL, 7.5 mM) và dung dịch đệm NH4Ac (1 mL, 1 M, pH 7.0). Sau đó, độ hấp thụ được xác định ở 450 nm sau khi ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
3.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Dữ liệu thực nghiệm được phân tích bằng phần mềm SPSS 15 (SPSS Inc. Chicago, U.S.A) sử dụng những kỹ thuật thống kê cơ bản. Phân tích phương sai một nhân tố (one-way ANOVA) được áp dụng để xác định sự khác nhau giữa các chế độ xử lý mẫu và Tukey’s Multiple Range test được áp dụng để xác định sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình ở mức ý nghĩa 5%. Tất cả thí nghiệm và những chỉ tiêu phân tích được lặp lại 3 lần.
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN