3.3.1 Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ ngày 15 tháng 6 năm 2019 đến ngày 15 tháng 9 năm 2019.
3.3.2 Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa phân tích, trường ĐH Nguyễn Tất Thành, 331 Quốc lộ 1A, Phường An Phú Đông, Quận 12, Tp.HCM.
3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1 Quy trình trích ly đài hoa bụp giấm
25 g mẫu bụp giấm khô xay nhuyễn được trích ly tại nhiệt độ 50ºC trong 30 phút bằng 100 mL dung môi ethanol 70% (v/v) được acid hóa đến pH 2 bằng cách sử dụng acid hydrochloric 2 N. Sau khi trích ly, dịch trích được thu nhận bằng cách lọc qua giấy lọc Whatman No.2. Dịch lọc được cô đặc bằng thiết bị cô quay chân không ở nhiệt độ 55ºC trong 30 phút để loại bỏ dung môi ethanol.
Để xác định lượng chất mang cần thiết trong quá trình vi bao, dịch cô đặc được phân tích hàm lượng anthocyanin. Kết quả thu được cho thấy dịch bụp giấm cô đặc có hàm lượng anthocyanin là 1.08 g/L.
3.4.2 Quy trình sấy phun dịch trích anthocyanin từ đài hoa bụp giấm
Dịch trích anthocyanin sau khi cô đặc được phối trộn với maltodextrin theo tỉ lệ nồng độ giữa anthocyanin và chất mang là 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100. Quá trình sấy phun được tiến hành trong thiết bị sấy phun Labplant SD-06AG (Keison, UK). Tốc độ nhập liệu được cố định ở 500 mL/h. Nhiệt độ đầu vào được khảo sát ở 3 mức là 150°C, 160°C, 170°C với nhiệt độ đầu ra lần lượt là 91°C, 99 °C và 98°C. Các mẫu sau khi sấy phun được bảo quản lạnh ở 4°C trong túi polyethylene cho đến khi đem phân tích.
3.5 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
3.5.1 Xác định hoạt tính bắt gốc tự do DPPH
Phương pháp DPPH được xem là một trong những phương pháp so màu chuẩn và dễ dàng để đánh giá các đặc tính chống oxy hóa của các hợp chất chống oxy hóa. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc gốc tự do DPPH nhận nguyên tử hydro (H) của chất chống oxy hóa, dẫn đến giảm DPPH làm thay đổi màu sắc từ màu tím sang màu vàng [36].
Dung dịch gốc được pha chế bằng cách hòa tan 24 mg DPPH với 100 mL methanol và sau đó được bảo quản ở nhiệt độ 4ºC cho đến khi đạt được 48 giờ. Dung dịch thuốc thử được pha loãng bằng methanol về độ hấp thụ 1.10 ± 0.02 đơn vị ở 515 nm bằng máy đo quang phổ. Dung dịch phân tích (150 μL) được phản ứng với 2850 μL dung dịch DPPH trong 30 phút trong điều kiện tối. Sau đó, độ hấp thụ được thực hiện ở 515nm bằng máy đo quang phổ.
3.5.2 Xác định hoạt tính bắt gốc tự do ABTS
Trong phương pháp này, ABTS•+ bị oxy hóa bởi kali persulfate tạo thành cation gốc của nó (ABTS+) có màu xanh đậm. Khả năng bắt gốc tự do và khả năng chống oxy hóa của các hợp chất được đo bằng khả năng làm giảm màu của thuốc thử khi phản ứng trực tiếp với gốc ABTS. ABTS•+ được áp dụng cho cả hợp chất ưa béo và ưa nước [37].
Dung dịch ABTS•+ được pha loãng với methanol để thu được độ hấp thụ 1.10 ± 0.02 ở 734 nm. Dung dịch phân tích (150 μL) được phản ứng với 2850 μL thuốc thử ABTS trong 30 phút trong điều kiện tối. Sau đó, độ hấp thụ được thực hiện ở 734 nm bằng máy quang phổ.
3.5.3 Xác định hoạt tính khử sắt (FRAP)
Phương pháp FRAP đo khả năng của các chất chống oxy hóa khử phức hợp sắt 2,4,6-tripyridyl-s-triazine [Fe3+-(TPTZ)2]3+ thành phức chất màu có màu xanh đậm [Fe2+-(TPTZ)2]2+ trong môi trường acid [38].
Thuốc thử FRAP được điều chế như sau: dung dịch đệm acetate (300 mM, pH 3.6), dung dịch TPTZ được pha trong HCl (40 mM) và dung dịch FeCl3.6H2O (20 mM) được trộn theo tỷ lệ thể tích 10:1:1. Dịch phân tích (150 µL) được cho phản ứng với 2850 µL thuốc thử FRAP trong 30 phút trong bóng tối. Sau đó, độ hấp thu được đo ở bước sóng 593 nm.
3.5.4 Xác định hoạt tính khử đồng (CUPRAC)
Phương pháp CUPRAC dựa trên phép đo độ hấp thụ của Cu (I) - chocate neocuproine (Nc) được hình thành do phản ứng oxi hóa khử của các chất chống oxy hóa phá vỡ chuỗi bằng thuốc thử CUPRAC, Cu (II)-Nc, trong đó độ hấp thụ được ghi nhận tại bước sóng hấp thụ ánh sáng cực đại 450nm [39].
Dịch phân tích (0.5 mL) được thêm vào hỗn hợp phản ứng có chứa CuCl2 (1 mL, 10 mM), neocuproine (1 mL, 7.5 mM) và dung dịch đệm NH4Ac (1 mL, 1 M, pH 7.0). Sau đó, độ hấp thụ được xác định ở 450 nm sau khi ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
3.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Dữ liệu thực nghiệm được phân tích bằng phần mềm SPSS 15 (SPSS Inc. Chicago, U.S.A) sử dụng những kỹ thuật thống kê cơ bản. Phân tích phương sai một nhân tố (one-way ANOVA) được áp dụng để xác định sự khác nhau giữa các chế độ xử lý mẫu và Tukey’s Multiple Range test được áp dụng để xác định sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình ở mức ý nghĩa 5%. Tất cả thí nghiệm và những chỉ tiêu phân tích được lặp lại 3 lần.
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN SẤY PHUN LÊN DPPH VÀ ABTS
Khả năng chống oxy hóa của thực phẩm được xác định bởi sự hiện diện của các chất chống oxy hóa khác nhau, với các cơ chế hoạt động khác nhau, do đó, khả năng chống oxy hóa của các sản phẩm thực phẩm nên được đánh giá bằng nhiều phương pháp xảy ra với các cơ chế khác nhau [40].
Trong nghiên cứu này, bốn phương pháp khác nhau đã được sử dụng để xác định khả năng chống oxy hóa. Sự đóng góp đáng kể của các hợp chất này trong bột roselle phun khô có thể được quy cho khả năng của quá trình vi nang hiệu quả được tạo điều kiện thuận lợi bằng cách sử dụng maltodextrin [41].
Maltodextrin là một loại tinh bột thủy phân được sản xuất bằng cách thủy phân một phần tinh bột bằng acid hoặc enzyme thường được sử dụng làm nguyên liệu trong quá trình vi nang của các thành phần thực phẩm [42], [43]. Maltodextrin với DE thấp hơn chứa một tỷ lệ lớn các saccharide chuỗi dài, có thể dẫn đến nứt bề mặt và giảm rào cản oxy. Maltodextrin với DE cao hơn có thể tạo thành các hệ thống tường không thấm oxy và đậm đặc hơn để giữ lại các sắc tố anthocyanin tốt hơn [44]. Maltodextrin được phân loại trên cơ sở các giá trị tương đương dextrose (DE) của chúng và nguồn tinh bột mà chúng có nguồn gốc. Giá trị DE là mức độ thủy phân tinh bột thành xi-rô glucose: thuật ngữ của maltodextrin thường được sử dụng cho các giá trị DE tương ứng <20 và ≥20. Nói chung, các tính chất của maltodextrin có giá trị DE thấp hơn (nghĩa là ít bị thủy phân) gần với các loại tinh bột hơn, từ đó chúng có nguồn gốc; nghĩa là độ hút ẩm và độ hòa tan của chúng tăng lên trong khi độ tinh thể và khả năng bulking của chúng giảm khi giá trị DE tăng [45].
Các polysaccharide này cũng được sử dụng làm chất làm đặc để thay đổi các đặc
tính vật lý và cấu trúc của các sản phẩm thực phẩm cung cấp những thay đổi rõ rệt về
kết cấu, hương vị có trong thực phẩm [46][47].
Maltodextrin được coi là tác nhân vi bao tốt bởi vì nó thể hiện độ nhớt thấp ở hàm lượng chất rắn cao và độ hòa tan tốt. Maltodextrin được sử dụng chủ yếu làm chất hỗ trợ trong quá trình sấy phun, sấy khô nước ép trái cây, làm tăng nhiệt độ chuyển thủy tinh, làm giảm độ dính của bột và tạo sự ổn định cho bột. Rõ ràng, chúng có khả năng hình thành ma trận rất cần thiết trong việc hình thành các hệ thống tường [48]. Nó mang lại những ưu điểm có lợi như chi phí tương đối thấp, mùi thơm và hương vị
trung tính, độ nhớt thấp ở nồng độ chất rắn cao và bảo vệ tốt các hương vị chống lại quá trình oxy hóa [49]. Tuy nhiên, hạn chế lớn nhất của vật liệu tường này là khả năng nhũ hóa thấp và khả năng lưu giữ biên của các chất bay hơi [50], [51]. Do đó, nó thường được sử dụng trong hỗn hợp với các vật liệu tường khác. Các tác nhân chất mang có thể được kết hợp để có được một ma trận hiệu quả và ổn định hơn [49].
DPPH (mg TE/g DW) 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1:50 1:60 1:70 1:80 1:90 1:100 ACN:MD (w/w) 150°C 160°C 170°C
Hình 4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun (°C) và tỷ lệ anthocyanin:maltodextrin (w/w) lên hoạt tính bắt gốc tự do DPPH (mg TE/g DW) của bột bụp giấm sấy phun
Theo Suhag and Nanda (2016), hoạt động chống oxy hóa bột mật ong DPPH• dễ bị suy thoái do nhiệt trong quá trình sấy phun [52]. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất mang và nhiệt độ sấy phun lên khả năng bắt gốc tự do DPPH• từ đài hoa bụp giấm được thể hiện trên Hình 4.1. Kết quả cho thấy rằng nhiệt độ sấy phun và tỷ lệ chất mang cao gây ra ảnh hưởng đáng kể lên khả năng bắt gốc tự do DPPH•. Tỷ lệ chất mang tăng dẫn đến sự giảm đáng kể về khả năng bắt gốc tự do DPPH•. Khi tăng tỷ lệ chất mang từ 1:50 đến 1:100 thì khả năng bắt gốc tự do DPPH• giảm từ khoảng 4375.36−4384.02 mg TE/g DW đến 2418.02−3004.36 mg TE/g DW tương ứng. Ngoài ra, ở tỷ lệ chất mang cao (1:80−1:100) thì nhiệt độ sấy phun cao (170ºC) ảnh hưởng đáng kể lên khả năng bắt gốc tự do DPPH•. Điều này có thể được gây ra bởi sự gia tăng số lượng các
thành phần hoạt động bay hơi hoặc suy giảm. Ở mức tỷ lệ chất mang 1:50, khả năng bắt gốc tự do DPPH• và lượng các thành phần không hoạt động nhỏ hơn thì hiệu suất vi bao được tối đa hóa. Khi nhiệt độ không khí đầu vào tăng trong 1:50 và 1:70, tỷ lệ hoạt động bắt gốc tự do DPPH• cũng giảm; điều này có thể là do sự biến động của các thành phần hoạt tính sinh học hoặc các thành phần suy giảm.
Theo Mishra (2013), tăng nồng độ maltodextrin mà bản thân nó không có hoạt động bắt gốc tự do, dẫn đến hoạt động bắt gốc DPPH• thấp hơn. Bột có chứa 5% maltodextrin cho khả năng bắt gốc tự do cao hơn đáng kể (cơ sở wt khô) so với tỉ lệ 7 và 9% maltodextrin do tác dụng pha loãng của maltodextrin khi nồng độ của nó được tăng [53]. Tương tự, kết quả trong sấy phun bột trích từ dịch gấc được sấy phun của [54]. Do hoạt động bắt gốc tự do thấp tiếp xúc với nhiệt độ cao hơn đã ảnh hưởng xấu đến cấu trúc của phenolics gây ra sự phá vỡ và hoặc tổng hợp thành các dạng khác nhau. Theo Silva (2014), bằng cách sấy phun trích từ vỏ nho đen jabuticaba (Myrciaria cauliflora). Một mối tương quan cao giữa lượng hợp chất phenolic và khả năng chống oxy hóa đã được quan sát thấy trong tất cả các loại bột được kiểm tra. [55].
Theo tác giả Souza (2014), khi vi bao dịch trích chứa anthocyanin từ trái nho Bordo (Vitis labrusca) sử dụng chất mang maltodextrin (DE=10) tại nhiệt độ sấy phun 130ºC−170°C, việc tăng tỷ lệ chất mang từ 10% lên 30% (w/w) làm giảm đáng kể khả năng bắt gốc tự do DPPH• của bột từ trái nho Bordo (Vitis labrusca) từ khoảng 25.4−74.9 μmol/g đến 28.0−69.8 μmol/g [56].
Trong xét nghiệm DPPH•, các chất chống oxy hóa có thể làm giảm DPPH• gốc màu tím ổn định thành diphenyl-picrylhydrazine màu vàng. Phương pháp này dựa trên việc giảm DPPH• trong dung dịch cồn với sự có mặt của chất chống oxy hóa tặng hydro do sự hình thành dạng DPPH-H không gốc trong phản ứng.
Nhiệt độ cao ảnh hưởng xấu đến cấu trúc của các hợp chất phenolic, gây phá vỡ cấu trúc, dẫn đến sự hình thành các hợp chất khác nhau, do đó làm giảm hoạt động chống oxy hóa [53]. Tuy nhiên, khả năng chống oxy hóa thấp hơn đã được tìm thấy trong đóng gói với nồng độ maltodextrin cao hơn so với đóng gói với nồng độ thấp hơn [53]. Tăng nồng độ maltodextrin mà bản thân nó không có hoạt động bắt gốc tự do, dẫn đến hoạt động bắt gốc tự do DPPH thấp hơn. Bột Amla (Emblica officinalis) chứa 5% mức maltodextrin cho thấy hoạt động bắt gốc tự do cao hơn đáng kể (cơ sở wt khô) so với 7 và 9% maltodextrin.
Đây có thể là tác dụng pha loãng của maltodextrin khi nồng độ của nó được nâng lên. Kết quả thu được mâu thuẫn với kết quả của Tuyen et al. (2010) đã nghiên cứu bột
nước gấc (Momordica cochinchinensis) đã phát hiện ra rằng việc thay đổi mức độ maltodextrin từ 10 đến 20% không có tác dụng đáng kể đối với toàn bộ hoạt động chống oxy hóa [54]. Trong việc lựa chọn vật liệu tường, maltodextrin rất hữu ích vì cân bằng tốt giữa chi phí và hiệu quả do nó có độ nhớt thấp ở tỷ lệ rắn cao và có sẵn ở các trọng lượng phân tử trung bình khác nhau [48], [57].
ABTS (mg TE/g DW) 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 1:50 1:60 1:70 1:80 1:90 1:100 ACN:MD (w/w) 150°C 160°C 170°C
Hình 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun (°C) và tỷ lệ anthocyanin:maltodextrin (w/w) lên hoạt tính bắt gốc tự do ABTS (mg TE/g DW) của bột bụp giấm sấy phun
Khả năng chống oxy hóa của đài hoa bụp giấm sấy phun đã được xác định dựa trên cơ sở khả năng bắt gốc của gốc ABTS• tự do ổn định (Hình 4.2). Phương pháp dựa trên việc theo dõi sự giảm độ hấp thu của dung dịch gốc, điều này cho thấy rằng nhiệt độ sấy phun và tỷ lệ chất mang ảnh hưởng đáng kể lên hoạt tính chống oxy hoá của bột với các dung dịch có màu ổn định của ABTS•. Tỷ lệ chất mang càng tăng dẫn khả năng chống oxy hoá càng giảm. Khi tăng tỷ lệ chất mang từ 1:50 đến 1:100 thì khả năng chống oxy hoá giảm từ khoảng 7545.98−8291.80 mg TE/g DW đến 4540.61−6240.78 mg TE/g DW tương ứng. Nhìn chung, ở tỷ lệ chất mang cao (1:100) thì nhiệt độ sấy phun ảnh hưởng không đáng kể lên sự gia tăng hoạt động bắt gốc ABTS•.
Theo Peng (2013), đã quan sát thấy rằng tỷ lệ lõi với lớp phủ có ảnh hưởng đáng kể (p<0.05) đến hoạt động chống oxy hóa [58]. Hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu được đóng gói được đánh giá bằng cách đo hoạt động quét gốc của chúng bằng phương pháp ABTS•. So với vật liệu cốt lõi, việc giảm hoạt tính chống oxy hóa của mẫu đóng gói P1, P2 và P3 được quan sát tương ứng với 85.90 và 93%, có thể là do sự khác biệt về nồng độ thủy phân hiệu quả. Xu hướng thay đổi hoạt động chống oxy hóa sau khi đóng gói tương tự như báo cáo trước đó đối với các thành phần hoạt tính sinh học khác [58].
Xét nghiệm ABTS• thể hiện gốc màu xanh lam/xanh lục được tạo ra từ quá trình oxy hóa ABTS• bằng kali persulfate, xét nghiệm này bị giảm khi có chất chống oxy hóa và mức độ khử màu được xác định tại một thời điểm cố định. Thử nghiệm này để đánh giá hoạt động bắt gốc tự do triệt để của các peptide [59]. Nhiệt độ cao ảnh hưởng xấu đến các cấu trúc, gây vỡ cấu trúc, dẫn đến sự hình thành các hợp chất khác nhau, do đó làm giảm hoạt động chống oxy hóa.
4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN SẤY PHUN LÊN FRAP VÀ CUPRAC
FRAP (mg TE/g DW) 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 1:50 1:60 1:70 1:80 1:90 1:100 ACN:MD (w/w) 150°C 160°C 170°C
Hình 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun (°C) và tỷ lệ anthocyanin:maltodextrin (w/w) lên hoạt tính khử sắt FRAP (mg TE/g DW) của bột bụp giấm sấy phun
Ảnh hưởng của tỷ lệ chất mang và nhiệt độ sấy phun lên hoạt tính chống oxy hóa từ đài hoa bụp giấm được thể hiện trên Hình 4.3. Kết quả cho thấy rằng tỷ lệ chất mang ảnh hưởng đáng kể lên khả năng khử ion Fe3+ của hoạt tính chống oxy hóa (FRAP). Tỷ lệ chất mang tăng dẫn đến giảm hoạt tính chống oxy hóa. Khi tăng tỷ lệ chất mang từ 1:50 đến 1:100 thì hợp chất chống oxy hóa giảm từ khoảng 7238.74‒ 8826.19 mg TE/g DW đến 5104.35−5278.86 mg TE/g DW tương ứng. Ngoài ra, ở tỷ lệ chất mang cao (1:100) thì nhiệt độ sấy phun ảnh hưởng không đáng kể đến hoạt tính chống oxy hóa của mẫu.
Tonon (2008) đã phát hiện ra rằng hàm lượng anthocyanin giảm từ 86.01 xuống 79.09% khi tăng nhiệt độ từ 150 đến 190°C trong sấy phun Acai (Euterpe oleraceae
