3.2.1 Môi trường và thiết bị phân tích
Môi trường và thuốc thử:
- Thạch và canh MRS (Merck, pH= 5,7± 0,2) để phân lập, tăng sinh và giữ giống vi sinh vật.
- Môi trường NB (Difco) để tăng sinh và giữ giống vi sinh vật gây bệnh.
- Môi trường MRD dùng để pha loãng.
- Môi trường TSA (Difco) dùng để thực hiện thí nghiệm khuếch tán trên đĩa thạch.
- Môi trường carbohydrat dùng khảo sát khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn lactic phân lập.
- Thuốc thử Uphenmen dùng khảo sát sự hiện diện của acid lactic.
- Thuốc thử peroxyde hydrogene 10% để thử phản ứng catalase.
- Thuốc nhuộm Gram: gential violet, lugol và fuschine.
Dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, pipet, micropipet, que cấy, đèn cồn…
Thiết bị: Máy dập mẫu (Seward, Anh), máy li tâm (MSE Mistral 1000,
Anh), autoclave (Sanyo, Nhật), cân điện tử (Ohaus, Mĩ), vortex (Velp, Ý), máy đo pH (Metrohm, Mỹ), tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi,…
3.2.2 Nguyên vật liệu thí nghiệm
Nem khảo sát được lấy sau 4 ngày lên men của 5 cơ sở: Bà Chín (Thủ Đức, tp. Hồ Chí Minh), Ninh Hòa (Nha Trang, Khánh Hòa), Giáo Thơ (Lai Vung, Đồng Tháp),
Vissan (tp. Hồ Chí Minh) và Năm Thu (Bình Định). Trong đó, nem Bà Chín, nem Ninh Hòa và nem Năm Thu là sản phẩm của quá trình lên men tự nhiên còn quá trình lên men của nem Giáo Thơ và nem Vissan là có sử dụng giống khởi động.
Năm chủng gây bệnh được bảo quản đông lạnh (-20oC) được sử dụng làm chủng chỉ thị, bao gồm:
Staphylococcus aureus ssp. aureus CIP 20256
E. coli ATCC 25922
Bacillus cereus CIP 6624T
Listeria monocytogenes CIP 82110 T
Salmonella indiana LMBA
Thuốc kháng sinh Ofloxacin 200 mg được bán trên thị trường được sử dụng làm mẫu đối chứng cho thí nghiệm khuếch tán trên thạch.
3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Chúng tôi đã thực hiện các công việc như sau:
Khảo sát hệ vi khuẩn lactic của nem sau 4 ngày lên men của năm cơ sở.
Thực hiện các phản ứng sinh hóa tiền định danh vi khuẩn lactic.
Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được.
3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Kett--noii..com kho taiti lieuli mieni phii
Lấy mẫu Đồng nhất mẫu
Huyền phù mẹ
Đo pH Pha loãng mẫu ở các
nồng độ từ 10-2 đến 10-7
Cấy lên môi trường thạch MRS
Ủ 30oC / 48 giờ - Đếm số lượng khuẩn lạc
- Tính phần trăm dạng khuẩn lạc
- Giữ giống.
- Cấy chuyền.
Kiểm tra các phản ứng sinh hóa
- Nhuộm Gram - Catalase - Di động
- Kiểu lên men
- Khả năng sinh acid lactic
Khảo sát sơ bộ Khảo sát khả năng kháng khuẩn
Khuếch tán trên thạch
3.4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên nem ngày bốn của năm cơ sở khảo sát
3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu
Đối với mỗi cơ sở chế biến nem khảo sát, chúng tôi tiến hành lấy mẫu lặp lại 3 lần ở những lô sản xuất khác nhau. Các mẫu nem chua được vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để tiến hành phân tích trong thời gian sớm nhất.
3.4.1.2 Đồng nhất mẫu
Sau khi tiệt trùng dao kĩ bằng cồn, dao được hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho bay hết hơi cồn và để nguội. Dùng dao cắt nhỏ mẫu nem và lấy khoảng 10 g mẫu nem cho vào bao PE vô trùng. Sau đó cho thêm dung dịch MRD vào bao theo tỉ lệ 9 MRD:1 nem. Việc đồng nhất mẫu được thực hiện với máy Stomacher trong 2 phút. Sau khi đồng nhất, thu được dung dịch huyền phù mẹ (S1).
3.4.1.3 Kỹ thuật đo pH
Dung dịch S1 sẽ được đem đi đo pH. Trước khi đo, đầu pH kế được lau sạch; sau đó, được cắm vào dung dịch mẫu sao cho dung dịch ngập qua đầu dò của pH kế. Mỗi mẫu được đo lặp lại 3 lần và giá trị pH ghi nhận cho mỗi mẫu là trung bình của 3 lần đo lặp lại.
3.4.1.4 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic
Pha loãng mẫu và cấy đĩa
Tiến hành pha loãng thập phân dung dịch S1 đến nồng độ 10-7 bằng dung dịch MRD. Dùng micropipet hút 0,1 mL dung dịch ở các nồng độ 10-5, 10-6 và 10-7 cho vào đĩa petri. Dùng que cấy trang đã khử trùng trang đều lên bề mặt thạch cho đến khi thấy bề mặt thạch khô. Ở mỗi nồng độ pha loãng chúng tôi tiến hành lặp lại 2 lần.
Trình tự các thao tác được trình bày qua Hình 3.2.
Kett--noii..com kho taiti lieuli mieni phii
Phương pháp ủ
Các đĩa petri sau khi cấy xong sẽ được ủ kị khí ở 30oC trong 48 giờ. Việc ủ kị khí được tiến hành bằng cách để các đĩa petri vào trong các bình hút ẩm, đặt vào đó ngọn đèn cồn đã được thắp sáng, đậy chặt nắp, khi ngọn lửa đèn cồn tắt đồng nghĩa với việc oxy trong bình đã được tiêu thụ hết.
3.4.1.5 Đếm khuẩn lạc và cấy chuyền
Sau khi ủ ở 30oC trong 48 giờ, việc đếm khuẩn lạc được thực hiện trên các đĩa có số lượng khuẩn lạc từ 15 đến 300.
Số lượng khuẩn lạc đếm được trong hai đĩa ở hai nồng độ liên tiếp được tính bởi công thức sau:
C
N
V .d.(n 0,1.n )(CFU/g)
1 2
Trong đó: N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g mẫu.
C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n1: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ 1 n2: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ 2
V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa d: nồng độ pha loãng đầu tiên được nuôi cấy.
Số lượng trung bình của khuẩn lạc được đếm cho 3 lần lặp lại của 1 mẫu thí nghiệm: N N 1N 2 N 3 (CFU/g) 3
Với N1, N2, N3 là tổng số khuẩn lạc được tính trong lần lặp lại thứ nhất, thứ hai và thứ ba.
Sau khi đếm khuẩn lạc, với quan sát bằng mắt thường, các dạng khuẩn lạc hiện diện được ghi nhận dựa trên hình dạng và kích thước của chúng.
Đối với mỗi dạng khuẩn lạc chúng tôi tiến hành cấy chuyền và giữ giống bằng cách lấy khuẩn lạc cho vào ống eppendorf vô trùng có chứa 1 mL canh MRS và ủ ở 37oC trong 24 giờ trong tủ ấm. Sau đó, cấy chuyền lên môi trường thạch MRS và ủ ở 37oC trong 48 giờ để tiến hành các phản ứng sinh hóa tiếp theo. Những ống eppendorf được bổ sung glycerol tiệt trùng hai lần với thể tích 10% thể tích dịch khuẩn, sau đó được bảo quản đông lạnh để giữ giống.
3.4.2 Định danh sơ bộ vi khuẩn lactic phân lập
3.4.2.1 Nhuộm Gram
Sau khi ủ ở 37oC trong 48 giờ, các chủng vi khuẩn phân lập, đại diện cho các dạng khuẩn lạc được nhuộm Gram. Việc quan sát dưới kính hiển vi sau đó cho chúng tôi khái niệm ban đầu về hình thái tế bào vi sinh vật như khả năng bắt màu (Gram (+) hay Gram (-)); dạng vi khuẩn (hình que, cầu hay hình trứng) cũng như cách sắp xếp của chúng (xếp chuỗi, bắt cặp hay riêng lẻ).
3.4.2.2 Phản ứng catalase
Lấy khuẩn lạc cho lên trên miếng lame sạch, sau đó nhỏ một giọt H202 10% lên. Nếu thấy xuất hiện bọt trắng thì phản ứng là dương tính còn không xuất hiện bọt trắng thì phản ứng là âm tính.
3.4.2.3 Khảo sát khả năng di động
Dùng que cấy vô trùng để lấy khuẩn lạc và cấy sâu vào trong ống nghiệm có chứa 10 mL môi trường thạch mềm MRS (4 g agar/L môi trường) và đem ủ ở 37oC trong 48 giờ trong điều kiện kị khí, tính di động của vi sinh vật được quan sát bởi sự phân tán vi sinh vật trong môi trường so với đường cấy: nếu vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động, nếu vi khuẩn mọc theo đường cấy thì chúng không có khả năng di động.
3.4.2.4 Kiểm tra kiểu lên men
Cho khuẩn lạc vào trong ống nghiệm có chứa môi trường carbohydrat đã thêm bromocresol tía. Ủ các ống nghiệm này ở 37oC trong 24 giờ. Tiến hành kiểm tra khả năng sinh khí của vi sinh vật bằng cách dùng que cấy đã hơ thật nóng trên ngọn lửa đèn cồn rồi nhúng nhanh vào trong ống nghiệm. Nếu thấy xuất hiện những bọt khí nhỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh khí; ngược lại, vi khuẩn không có khả năng sinh khí.
3.4.2.5 Khảo sát khả năng sinh acid lactic
Môi trường carbohydrat sau khảo sát khả năng lên men (phần 3.4.2.4) được trung hòa bằng dung dịch NaOH 0,1N để môi trường chuyển lại thành màu tím. Thêm vào 2 mL dung dịch Uphenmen, sự tồn tại của acid lactic sẽ được thể hiện bởi sự chuyển màu chất chỉ thị từ tía sang vàng.
3.4.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập
Kett--noii..com kho taiti lieuli mieni phii
Sau khi tiến hành các phản ứng sinh hóa, chúng tôi chọn lọc ra những chủng vi khuẩn được cho là vi khuẩn lactic để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc cho vào trong ống ly tâm vô trùng chứa 10 mL MRS bổ sung 2% cao nấm men (Elmoualdi và ctv, 2008). Ủ các ống ly tâm này
ở 37oC trong 16 - 18 giờ (Cheikhyoussef và ctv, 2008).
Sau đó, các ống ly tâm này sẽ được đem ly tâm ở 6000 vòng trong 15 phút để tách cặn khuẩn. Nhằm tránh ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm bởi sự ức chế gây ra từ các acid hữu cơ có mặt trong môi trường, sau khi ly tâm xong chúng tôi điều chỉnh pH của dịch khuẩn bằng dung dịch NaOH 10N để đạt đến pH = 6,5 (Poncea và ctv, 2007). Sau đó lọc lấy phần dịch nổi trên bề mặt bằng cách bơm dịch qua màng lọc Minisart (đường kính lỗ lọc là 0,2 µm) để tách cặn khuẩn còn sót lại. Phần dịch lỏng thu được sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.3.2 Khảo sát sơ bộ khả năng sinh bateriocin của các chủng vi khuẩn phân lập
Tiến hành tăng sinh năm chủng chỉ thị gây bệnh trong 10 mL môi trường NB (37oC / 24 giờ). Sau đó tiến hành pha loãng năm chủng chỉ thị đến nồng độ 10-4 bằng dung dịch MRD.
Dùng micropipet hút 0,5 mL dịch ly tâm cho vào ống eppendorf vô trùng, sau đó cho tiếp 0,5 mL dịch khuẩn chỉ thị ở nồng độ 10-4. Mỗi dịch ly tâm đều được khảo sát với năm chủng gây bệnh nghiên cứu.
Ủ các ống eppendorf ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó so sánh bằng mắt thường độ trong, đục của chúng với ống đối chứng (không cho dịch khuẩn). Nếu ống trong và không có sinh khối điều này chứng tỏ dịch ly tâm trong ống có khả năng kháng lại chủng chỉ thị gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng. Ngược lại, nếu ống đục và có sinh khối, điều này đồng nghĩa với việc vi khuẩn gây bệnh vẫn tiếp tục phát triển trong dịch ly tâm và như vậy, dịch ly tâm không có chứa chất kháng khuẩn.
Việc khảo sát sơ bộ này cho phép chúng tôi tuyển lược các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn cho khảo sát với phương pháp khuếch tán trên thạch tiếp theo.
3.4.3.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng lactic phân lập bằng phương pháp khuếch tán trên thạch phương pháp khuếch tán trên thạch
Trong khảo sát này, chúng tôi cấy vi khuẩn theo hai cách: trên bề mặt thạch và cấy sâu trong thạch: 0,1 mL dịch canh khuẩn chỉ thị ở nồng độ 10-4 được trang đều lên
bề mặt thạch TSA hoặc được trộn đều với 30 mL môi trường TSA và sau đó đổ ra đĩa petri. Sau khi thạch khô, đục 6 - 7 lỗ, với đường kính lỗ khoảng 8mm trên bề mặt đĩa thạch (Hata và ctv, 2009). Các lỗ được đục cách thành đĩa petri khoảng 1cm để có thể quan sát được vòng kháng khuẩn sau này. Kế đến, nhỏ khoảng một giọt môi trường TSA vào lỗ để bịt kín đáy lỗ. Dùng micropipet hút 150 µL dịch kháng khuẩn cho vào mỗi lỗ. Bên cạnh đó cũng tiến hành thí nghiệm với dịch kháng sinh pha loãng ở 10-4 để làm mẫu đối chứng. Tiếp theo, bảo quản các đĩa ở nhiệt độ 2 - 4oC trong 2 giờ với mục đích ngăn cản sự phát triển của chủng chỉ thị và tạo điều kiện cho bacteriocin có thời gian thẩm thấu vào bên trong thạch. Sau đó, các đĩa petri được ủ ở 37oC.
Việc đọc kết quả được thực hiện sau 16 giờ ủ. Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn được xác định bằng sự hiện diện của vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ. Nếu đường kính vùng kháng khuẩn lớn hơn hoặc bằng 6 mm (Cheikhyoussef và ctv, 2008) thì được xem là có khả năng ức chế tích cực.
Đường kính vùng kháng khuẩn được tính như sau: dkk = d – dlỗ
Trong đó: dkk: đường kính vùng kháng khuẩn xung quanh lỗ
d: đường kính vùng ức chế (bao gồm đường kính lỗ) dlỗ: đường kính lỗ.
Kett--noii..com kho taiti lieuli mieni phii
3.5 XỬ LÝ THỐNG KÊ SỐ LIỆU THU THẬP
Việc tính các giá trị trung bình ( pH , N ), tổng lượng khuẩn lạc và phần trăm các dạng khuẩn lạc được thực hiện với phần mềm Excel 2003.
Việc tính toán SD, sự khác biệt giữa các lô thí nghiệm được tính với trắc nghiệm Fisher bằng phần mềm Minitab 12.21.
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN LACTIC CỦA NEM CHUA SAU 4 NGÀY LÊNMEN Ở NĂM CƠ SỞ KHẢO SÁT MEN Ở NĂM CƠ SỞ KHẢO SÁT
4.1.1 Giá trị pH và tổng lượng vi khuẩn lactic của nem chua lên men ngày 4 ở 5 cơ sở khảo sát cơ sở khảo sát
Kết quả theo dõi về giá trị pH và tổng lượng vi khuẩn lactic của nem chua sau 4 ngày lên men ở 5 cơ sở khảo sát được trình bày ở Bảng 4.1
Bảng 4.1: Giá trị pH và tổng lượng vi khuẩn lactic của nem chua ngày 4
ở 5 cơ sở khảo sát
Tham số thống kê (n=3)
Kiểu lên men Cơ sở
pH SD N SD (CFU/g)
Bà Chín 4,39 0,03 1,43.108
7.106
Lên men tự nhiên Ninh Hòa 4,41 0,03 1,29.108
1,2.107
Năm Thu 4,34 0,03 1,62.108
1,5.107
Lên men có Vissan 4,15 0,03 1,15.109
8,5.107
định hướng Giáo Thơ 4,23 0,03 3,08.1087.106
(n: tổng số mẫu khảo sát, pH : giá trị pH trung bình của mẫu, N : số lượng vi khuẩn trung bình của mẫu, SD: độ lệch chuẩn)
Theo nghiên cứu trên nem chua lên men ngày 4 ở các cơ sở sản xuất theo kiểu lên men tự nhiên, kết quả phân tích thống kê chỉ ra rằng không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa pH của các mẫu nem ở 3 cơ sở khảo sát với độ tin cậy 95% (phụ lục 3). Qua Bảng 4.1, nem ở cơ sở Năm Thu có giá trị pH thấp nhất (vào khoảng 4,34 0,03) so với 2 cơ sở còn lại là Bà Chín (pH = 4,39 0,03) và Ninh Hòa (pH = 4,41 0,03). Sự khác biệt này là không đáng kể về mặt thống kê (p > 0,05). Theo nghiên cứu của Lý Ngọc Quí (2006) trên sản phẩm nem chua ở cơ sở Út Thẳng, pH của nem chua trong ngày lên men đầu tiên là 6,33 và ngày thứ 4 là 3,99. Sở dĩ có sự sụt giảm pH là do quá trình
Kett--noii..com kho taiti lieuli mieni phii
chuyển hóa đường trong nguyên liệu thành các acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic làm giảm pH của nguyên liệu.
Ở các cơ sở sản xuất nem theo kiểu lên men có định hướng, phân tích thống kê chỉ ra rằng pH của nem chua ở hai cơ sở Vissan và Giáo Thơ khác biệt nhau có ý nghĩa (p ≤ 0,05) (phụ lục 3). Giá trị pH của nem chua Giáo Thơ là 4,23 0,03 cao hơn so với nem Vissan (pH = 4,15 0,03). Giá trị pH ở 2 cơ sở này thấp hơn so với 3 cơ sở lên men tự nhiên. Điều này có lẽ là do quá trình lên men nem có định hướng tại các cơ sở này. Ở cơ sở Giáo Thơ người ta sử dụng một phần thịt đã lên men ngày hôm trước cho việc sản xuất nem chua ngày hôm sau (80 g bột thịt ngày 2 và 10 kg bột thịt ngày hôm trước được cho thêm vào 40 kg thịt xay của ngày sản xuất) (Lý Ngọc Quí, 2006). Khi