Ước tính trọng lượng phân tử protein bằng điện di SDS-PAGE là một thủ tục được sử dụng rộng rãi. Tính di động tương đối của một protein trong một SDS-PAGE gel có liên quan đến trọng lượng phân tử của nó. Một đường cong tiêu chuẩn được xây dựng với trọng lượng phân tử protein được gọi bằng cách vẽ các logarit của trọng lượng phân tử của chúng so với độ linh động tương đối của các protein. Tính di động tương đối của trọng lượng phân tử một protein khơng rõ sau đó được trang bị cho các đường cong để xác định khối lượng phân tử của nó.
Một đường cong chuẩn có thể được ngoại suy để cung cấp cho các y-giao điểm, đại diện cho giới hạn loại trừ trọng lượng phân tử rằng gel đặc biệt. Đó là, các protein có trọng lượng phân tử lớn hơn giá trị y-giao điểm sẽ hiển thị khơng tính di động và sẽ bị loại khỏi ma trận gel.
Gel polyme có độ rỗng lớn hơn do sự kéo dài chuỗi không đầy đủ và liên kết ngang. Kết quả là, giới hạn loại trừ sẽ lớn hơn cho một gel polyme nổi của acrylamide tương tự phần trăm. Hơn nữa, khi trùng hợp không đầy đủ, giới hạn loại trừ là irreproducible. Sử dụng các thuốc thử tạo gel tinh khiết và kỹ thuật trùng hợp đúng cách sẽ dẫn đến việc giới hạn loại trừ thấp nhất và tái sản xuất hầu hết cho một tổng phần trăm monomer nhất định.
Hình 2.9: Một đường cong hiệu chuẩn đại diện cho khối lượng phân tử (Mr) dự toán. Trong thời gian được vẽ ở đây ( đường liền nét ), Bio - Rad SDS -PAGE tiêu chuẩn với 200 , 116,2 , 97,4 , 66,2 , 45 , 31 , 21.5 , 14.4 và 6.5 kD (vịng trịn khép kín, từ trái sang bên phải) đã được
tách ra trên 15 % T SDS-PAGE gel
Hình 2.9 cho thấy một đường cong đặc trưng thu được bằng cách vẽ bản ghi trọng lượng phân tử tương đối so với di động sau SDS-PAGE cho một nhóm các protein tiêu chuẩn. Các antilog giá trị y-giao điểm này là 115.000 được xác định bằng phân tích hồi quy tuyến tính. Giới hạn loại trừ trọng lượng phân tử gần đúng của gel là như vậy, 115.000. Giá trị y-giao điểm được coi là gần đúng vì nó phụ thuộc vào di chuyển tương đối của các protein được sử dụng như là tiêu chuẩn. Mặc dù giá trị y-giao điểm sẽ khác
Khoa Cơng nghiệ hố học
25
nhau cho mỗi phần trăm acrylamide gel, và hơi khác nhau cho mỗi tập hợp các tiêu chuẩn, giá trị nên được đánh giá cao tái sản xuất từ gel để nếu tỷ lệ gel và acrylamide tiêu chuẩn cùng được sử dụng. Như vậy, theo dõi các y-giao điểm của trọng lượng phân tử log với tương đối tính di động là một đánh giá tuyệt vời của tái lặp trong kỹ thuật trùng hợp. *%C = (gram crosslinker x 100) / (gram monomer + gram crosslinker)
Đồ thị cho thấy sự phi tuyến tính cố hữu của những đường cong như vậy. Các đoạn đường thẳng ở giữa của đồ thị là phạm vi chính xác nhất dự tốn. Polypeptide lớn chịu sàng lớn hơn trong phạm vi giữa, do đó phần trên tương ứng của đường cong có độ dốc khác nhau hơn so với ở giữa. Các đường cong trong phạm vi nhỏ hơn polypeptide cũng lệch khỏi đường thẳng vì ít sàng. Bởi vì quy mơ là logarit, một ước tính của Mr từ một đường thẳng (đứt) "phù hợp nhất" là chấp nhận được cho nhiều mục đích.