2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
3.4. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GIỐNG BÔNG NGHIÊN
CỨU BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR
3.4.1. Tách chiết ADN tổng số của các giống bông phục vụ phân tích SSR
Mẫu lá non của 30 giống và 1 dòng bông kháng (KXL-00-02) đã được tiến hành tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB. Thí nghiệm tách chiết ADN tổng số được tiến hành tại phòng Sinh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp. ADN tổng số sau khi tách chiết được chạy trên gel agarose 0,8% để xác định chất lượng cũng như nồng độ (hình 3.5). Nồng độ ADN được kiểm tra lại bằng máy quang phổ Nanodrop để phục vụ cho phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR. Từ 31 mẫu lá đã thu được 31 mẫu ADN có chất lượng tốt với nồng độ khá cao, từ 200 – 1.500ng/µl.
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra ADN của các giống bông trên gel agarose 0,8%
Giếng số 1-31: ADN các giống bông nghiên cứu
Giếng ngoài cùng bên phải: λ ADN chuẩn với nồng độ 100ng
ADN tổng số của 30 giống và 1 dòng bông cỏ kháng bệnh xanh lùn sau khi tinh sạch được sử dụng để tiến hành làm phản ứng PCR với 50 chỉ thị phân tử SSR. Tuy nhiên, đối với hệ gen bông, việc xác định được những locus SSR cho các alen đa hình là tương đối khó khăn, chính vì vậy, trong số 50 cặp mồi nằm rải rác trên hệ gen bông đã nghiên cứu, chỉ có 15 cặp mồi cho kết quả đa hình, chiếm 30% tổng số cặp mồi. Số chỉ thị còn lại không cho đa hình giữa các giống, cho băng sản phẩm mờ hoặc không cho sản phẩm PCR, nên bị loại bỏ khỏi nghiên cứu. Hình 3.6 và 3.7 là ảnh gel minh họa đa hình ADN giữa các giống bông cỏ khi khảo sát với một số cặp mồi SSR. Kết quả cho thấy cặp mồi này đã cho đa hình ADN tương đối rõ giữa các giống bông.
Hình 3.6. Sản phẩm PCR của một số giống bông nghiên cứu với các cặp mồi nhóm BNL trên gel agarose 3%
Giếng 1: Thang ADN chuẩn 50 bp, Giếng 2-32: Sản phẩm PCR các giống bông (đánh số theo tên mã số tập đoàn)
Hình 3.7. Sản phẩm PCR của một số giống bông nghiên cứu với một số cặp mồi nhóm NAU, TM và STV trên gel agarose 3%
Giếng 1: Thang ADN chuẩn 50 bp, Giếng 2-32: Sản phẩm PCR các giống bông (đánh số theo tên mã số tập đoàn)
Số liệu phân tích kiểu gen được đưa vào phần mềm Excel để đánh giá các chỉ tiêu đa dạng chính, kết quả được tổng hợp ở bảng 3.7.
Với tổng số 15 locus SSR được phân tích, chúng tôi thu nhận được 34 allen, số allen/locus nằm trong khoảng từ 2-4, trung bình 2,3 allen/locus. Phần lớn các locus đều cho ít nhất 2 allen, bao gồm các locus: BNL1673, BNL2656, BNL2960,
BNL3259, BNL3261, BNL3284, BNL3478, BNL4053, NAU5074, STV002, TMD03, TME20. Chỉ có một locus cho nhiều allen nhất là BNL1408, 4 allen.
Trong nghiên cứu này, một số chỉ số khác cũng được đánh giá, đó là tần số allen phổ biến nhất, số allen cá biệt tại mỗi locus và chỉ số đa dạng PIC của từng locus SSR. Kết quả phân tích cho thấy, tần số allen phổ biến nhất dao động trong khoảng từ 41,3% đến 86,7%, tương ứng với chỉ thị BNL1408 và BNL2921, BNL2960. Đa phần các chỉ thị đều không cho allen cá biệt, chỉ có 2 chỉ thị BNL1679 và BNL2921 là cho một alen cá biệt ở cùng một giống bông Tka188 (BC44) của Ấn Độ. Chỉ số đa dạng PIC của các locus nghiên cứu thay đổi từ 0,231 đến 0,674, với giá trị trung bình là 0,414.
Bảng 3.7. Các chỉ tiêu về alen, chỉ số đa dạng PIC của các locus SSR nhận biết trên 31 giống bông nghiên cứu
T T Chỉ thị SSR NST Số allen Kích thước sản phẩm PCR (bp) Tần số allen phổ biến nhất Số allen cá biệt PIC 1 BNL1408 AD05,AD11 4 140-200 41,304 0 0,674 2 BNL1673 A12,AD12,AD22 2 135-150 64,516 0 0,458 3 BNL1679 A12,AD12 3 135-149 50,000 1 0,531 4 BNL2656 AD19 2 145-160 72,500 0 0,399 5 BNL2921 AD01 3 145-165 86,667 1 0,238 6 BNL2960 AD10 2 140-148 86,667 0 0,231 7 BNL3259 AD02,AD08,AD30 2 150-160 51,667 0 0,499 8 BNL3261 A12,AD12 2 145-152 66,667 0 0,444 9 BNL3284 AD11 2 130-135 83,871 0 0,271 10 BNL3478 AD13,AD18 2 150-157 79,310 0 0,328 11 BNL4053 AD09,AD23 2 150-175 83,333 0 0,278 12 NAU5074 A_chr08 2 225-250 56,098 0 0,493 13 STV002 A_chr05 2 120-130 61,290 0 0,475 14 TMD03 AD_chr01 2 210-230 55,172 0 0,495 15 TME20 AD_chr19 2 145-155 72,973 0 0,394 Tổng số 34 2 Trung bình 2,3 67,469 0,13 0,414 Min 2 41,304 0 0,231 Max 4 86,667 1 0,674
Chúng tôi đã tiến hành so sánh kết quả thu được trong nghiên cứu này với các kết quả về đánh giá đa dạng di truyền genom cây bông đã được công bố trong và ngoài nước. Kết quả phân tích được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền SSR trên cây bông đã được công bố
TT Tác giả Số
giống
Số Tổng Trung bình
Số allen PIC 1 Rehman và cs. (2009) 33 25 50 2,00 0,39 2 Khan và cs. (2009) 40 34 74 2,17 - 3 Boopathi và cs. (2008) 35 88 151 1,72 0,37 4 Dongre và cs. (2007) 19 17 30 1,76 0,38 5 Guang và cs. (2006) 43 36 130 3,60 0,62 6 Wangzhen Guo (2006) 109 60 128 2,18 - 7 Liu và cs. (2006) 39 74 165 2,23 0.41 8 Bertini và cs. (2006) 53 31 66 2,13 0,40 9 Nguyệt và cs. (2009) 49 50 128 2,56 -
10 Nghiên cứu này 30 15 34 2,3 0,41
Kết quả phân tích cho thấy số allen trung bình trong nghiên cứu thu được là khá cao, là 2,3; trong khi hầu hết các nghiên cứu còn lại đều có số allen trung bình thu được dưới 2,2 (Rehman và cs, 2009; Khan và cs, 2009; Boopathi và cs, 2008; Dongre và cs, 2007; Wangzhen Guo, 2006; Liu và cs, 2006; Bertini và cs, 2006). Khi so sánh về chỉ số đa dạng PIC giữa các nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy chỉ số đa dạng PIC của nghiên cứu này cũng có giá trị trung bình khá cao, 0,41, trong khi
các nghiên cứu tương tự có giá trị này đa số nằm trong khoảng từ 0,37 đến 0,41, duy chỉ có công trình của Guang và cs. (2006) thu được giá trị PIC trung bình cao nhất là 0,62.
Giá trị PIC trung bình phản ánh mức độ đa dạng chung cho tất cả các locus nghiên cứu. Điều này chứng tỏ những chỉ thị SSR được sử dụng trong nghiên cứu này đã cho kết quả đa dạng cao giữa các giống bông nghiên cứu và việc sử dụng những chỉ thị này sẽ có ý nghĩa khi phân tích đa hình di truyền cây bông.
3.4.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các giống bông nghiên cứu.
Số liệu phân tích SSR với các giống bông tiếp tục được đưa vào xử lý bằng phần mềm NTSYS pc2.1 để phân tích mức độ tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa các giống bông nghiên cứu. Kết quả thu được ở bảng 3.9 và hình 3.8.
Hệ số tương đồng di truyền phản ánh mối quan hệ di truyền của các giống bông với nhau. Kết quả cho thấy độ tương đồng di truyền giữa các giống bông nghiên cứu dao động từ 0,26 đến 0,97 với giá trị trung bình là 0,61, điều đó cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về mặt di truyền giữa các giống bông nghiên cứu khá cao. Hai giống bông cỏ nguồn gốc Ấn Độ, BC93 và BC94 (ký hiệu các giống bông theo mã số tập đoàn) có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,97.
Ở mức độ tương đồng di truyền khoảng 0,61, 31 giống bông đã phân tách thành 3 nhóm chính riêng biệt:
- Nhóm I gồm 3 giống bông với hệ số tương đồng dao động trong khoảng 0,62 – 0,71: BC2, BC3 và KXL.
- Nhóm II gồm 9 giống bông với hệ số tương đồng dao động từ 0,63 – 0,91. Tại hệ số tương đồng di truyền khoảng 0,70, các giống thuộc nhóm này đã phân thành 3 phân nhóm phụ:
+ Phân nhóm 1 gồm 3 giống: BC5, BC6, BC34 với hệ số tương đồng dao động từ 0,84 đến 0,91
+ Phân nhóm 2 gồm 4 giống: BC18, BC87,BC35, BC79 với hệ số tương đồng dao động từ 0,78 đến 0,88
- Nhóm III gồm 19 giống bông với hệ số tương đồng từ 0,64 – 0,97. Tại hệ số tương đồng di truyền khoảng 0,75, các giống thuộc nhóm này đã phân thành 4 phân nhóm chính:
+ Phân nhóm 1 gồm 4 giống: BC7, BC76, BC42, BC43 với hệ số tương đồng dao động từ 0,78 – 0,91
+ Phân nhóm 2 gồm 11 giống: BC15, BC100, BC80, BC92, BC86, BC82, BC81, BC93, BC94, BC83, BC85 với hệ số tương đồng từ 0,76 – 0,97
+ Phân nhóm 3 gồm 3 giống: BC75, BC78, BC77 với hệ số tương đồng từ 0,82 – 0,88.
+ Phân nhóm 4 gồm chỉ một giống là BC44.
Những kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống bông cỏ thông qua ma trận tương đồng di truyền và sơ đồ hình cây phân nhóm di truyền đã cho thấy sự đa dạng khá lớn về mặt di truyền giữa 31 dòng/giống bông nghiên cứu. Kết hợp kết quả phân nhóm di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR với những thông tin nổi trội về đặc tính nông sinh học của tập đoàn bông nghiên cứu, đề tài đã chọn lọc được một số dòng/giống bông đại diện cho các nhóm di truyền đồng thời có nguồn gốc khác nhau, xa cách về hệ số tương đồng di truyền. Những giống này sẽ là nguồn vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo về tạo lập cơ sở dữ liệu nguồn gen cây bông nhằm phục vụ cho quá trình lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn ở cây bông.
3.5. CHỌN CẶP LAI TRIỂN VỌNG TẠO QUẦN THỂ F1 PHỤC VỤ LẬP BẢN ĐỒ GEN KHÁNG BỆNH XANH LÙN. BẢN ĐỒ GEN KHÁNG BỆNH XANH LÙN.
Dựa trên kết quả đánh giá tính kháng/nhiễm bệnh xanh lùn, các đặc điểm nông sinh học và sự đa hình di truyền phân tử của 31 dòng/giống bông (gồm 30 giống nghiên cứu và 1 dòng kháng bệnh xanh lùn – KXL-00-02), các cặp dòng/giống bố mẹ mang các đặc điểm nông sinh học tốt và tính kháng/nhiễm tương phản đã được xác định làm vật liệu lai, tạo quần thể F1. Kết quả đánh giá tính kháng/nhiễm với rệp mang nguồn bệnh xanh lùn cho thấy nguồn gen kháng chỉ có ở giống Bông cỏ Nghệ An, đây là giống bông cỏ châu Á với hệ gen lưỡng bội nên việc chọn lọc các cặp lai phục vụ cho việc lập bản đồ gen kháng được tiến hành theo sơ đồ tổ hợp lai như sau:
Hình 3.9. Sơ đồ lai tạo tổ hợp lai F1
Từ các kết quả nghiên cứu về những đặc tính nông sinh học của các giống bông nghiên cứu, đề tài đã chọn lọc được 14 giống bông có tiềm năng năng suất tốt, chất lượng cao (bảng 3.6). Tuy nhiên, để chọn được những cặp lai triển vọng nhất để lai tạo F1, với mong muốn thế hệ lai F1 cho ưu thế lai và độ hữu thụ cao, việc kết hợp những kết quả đánh giá kiểu hình với kết quả phân tích kiểu gen là rất cần
thiết. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn các cặp bố mẹ có độ tương đồng di truyền nằm trong khoảng từ 0,3 đến 0,5.
Danh sách các giống bố mẹ dùng cho lai tạo quần thể F1 được liệt kê ở bảng 3.10.
Những quần thể F1 sau khi được lai tạo sẽ được tiếp tục chọn lọc và tạo thế hệ F2 phục vụ việc lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn ở cây bông cỏ Nghệ An.
Bảng 3.10. Danh sách các giống bố mẹ dùng cho lai tạo quần thể F1 Giống mẹ
(giống nhận gen)
Giống bố
(giống cho gen)
T T
M ã số
Tên giống Nguồn gốc Tương đồng di truyền với dòng KXL T T Tên giống Nguồn gốc 1 7 Cỏ Bắc Ái Việt NamViệt Nam 0,47 1 KXL- 00-02 Nghệ An – Việt NamViệt Nam 2 15 AK-235 Ấn Độ 0,35 3 42 Akola Ấn Độ 0,38 4 44 Tka188 Ấn Độ 0,41
5 46 Ava Liên Xô 0,50
6 75 B10 Ấn Độ 0,32 7 77 91-B-16 Ấn Độ 0,41 8 79 BAA(bar x arb) Ấn Độ 0,38 3 KXL- 00-04 Nghệ An – Việt NamViệt Nam 9 80 BAA(bar x arb) Ấn Độ 0,29 10 82 BAA(bar x arb) Ấn Độ 0,32
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN
1. Kết quả đánh giá tính kháng bệnh trên tập đoàn 30 giống bông cỏ nghiên cứu đã xác định được 4 dòng bông thuộc giống bông cỏ Nghệ An có khả năng kháng hoàn toàn với bệnh xanh lùn là: KXL-00-02, KXL-00-03, KXL-00-04, KXL- 00-05.
2. Kết quả đánh giá các đặc tính nông sinh học đã sàng lọc được 14 giống bông cho năng suất trên 4,0 tạ/ha và độ bền xơ trên 17,5g/tex phục vụ cho việc lai tạo quần thể F1.
3. Kết quả phân tích đa dạng di truyền 31 dòng/giống bông với 15 chỉ thị phân tử SSR đã thu được được tổng số 34 allen, với trung bình 2,3 allen/locus. Tần số allen phổ biến nhất dao động trong khoảng từ 41,3% đến 86,7%, trung bình là 67,45%. Chỉ số đa dạng PIC của các locus nghiên cứu cũng khá cao, với giá trị trung bình là 0,41.
4. Đã xác định được hệ số tương đồng di truyền giữa các giống bông dao động từ 0,26 đến 0,97 với giá trị trung bình là 0,61, từ đó xây dựng được sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa của 31 dòng/giống bông làm cơ sở di truyền cho những nghiên cứu tiếp theo.
5. Kết hợp đánh giá kiểu hình với phân tích kiểu gen của các giống bông đã xác định được các tổ hợp lai tiềm năng cho việc lai tạo quần thể lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn.
4.2. KIẾN NGHỊ
1. Lai tạo quần thể lập bản đồ từ nguồn vật liệu đã được xác định. 2. Xác định các chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh xanh lùn.
3. Chọn tạo giống bông kháng bệnh xanh lùn bằng sự trợ giúp của chỉ thị phân tử liên kết gen kháng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Thanh Bình (1999), Nghiên cứu bệnh xanh lùn bông ở phía Nam và một số biện pháp phòng trừ, Luận án tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt NamViệt Nam, Hà Nội.
2. Thái Thị Lệ Hằng (2008), Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử SSR đánh giá nguồn bông bố mẹ phục vụ chọn tạo giống bông lai F1, Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội.
3. Vũ Công Hậu (1987), Kỹ thuật trồng bông, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
4. Trần Thế Lâm (2007), Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái học và biện pháp phòng chống rầy xanh hai chấm Amrasca devastans Distant và rệp muội Aphis gossypii Glover hại bông ở vùng Duyên hải Nam trung Bộ, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông-lâm nghiệp Duyên hải Nam trung Bộ, Bình Định.
5. Vũ Triệu Mân, Nguyễn Văn Mẫn, Nguyễn Kim Giao (1995), “Chuẩn đoán virus Tristeza hại cam, chanh và virus gây bệnh xanh lùn cây bông ở miền nam Việt namViệt Nam”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(4), tr. 46-47.
6. Nguyễn tThị Minh Nguyệt, Phạm Anh Tuấn, Phạm tThị Hoa, Nguyễn thị Thị Tân Phương, Lã Tuấn Nghĩa, Nguyễn thị Thị Lan Hoa, Đặng Minh Tâm, Trịnh Minh Hợp, Nguyễn văn Chánh, Nguyễn thị Thị Thanh Bình, Nguyễn Duy Bảy, Nguyễn thị Thị Thanh Thủy (2009), “Phân tích đa dạng di truyền phân tử, các đặc tính nông sinh học và tính kháng bệnh xanh lùn ở một số giống bông vải trong nước và nhập nội”, Tạp chí công nghệ sinh học, 7(2), tr. 211- 219.
7. Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết và ứng dụng công nghệ gen trong chọn tạo giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 8. Lê Quang Quyến, Trần Ngọc Hùng (1993), Vài nét về cây bông ở Thái Lan và