a. Mục đích: Phân lập nhằm tách riêng các chủng nấm men và đưa về dạng thuần khiết từ quần thể vi sinh vật trên giống khóm Queen từ các nguồn khác nhau.
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại.
A1: mẫu khóm ở xã Vĩnh Hòa Hưng Nam, huyện Gò Quao, Kiên Giang A2: mẫu khóm ở xã Vĩnh Viễn A, huyện Long Mỹ, Hậu Giang
A3: khóm Cầu Đúc thuộc xã Hỏa Tiến, thị xã Vị Thanh, Hậu Giang Tổng số nghiệm thức: 9 nghiệm thức.
Hình 10. Sơđồ bố trí thí nghiệm
c. Phương pháp thực hiện: xắt lát cả vỏ và thịt quả cho vào máy ép (đã được rửa cồn 70o và để ráo). Chuẩn nước khóm đến 22 oBrix, pH 4,5 tạo môi trường thuận lợi cho nấm men phát triển. Ủ nước khóm trong bình tam giác đã tiệt trùng ở nhiệt độ phòng khoảng 24 giờ. Pha loãng dịch khóm bằng nước cất tiệt trùng 4, 5 lần, cấy mẫu lên đĩa petri có sẵn môi trường PGA (tất cả nồng độ), ủở 30oC từ 2-3
A1 A2 A3 Xắt lát cả vỏ và thịt quả Ép Nước khóm (chuẩn pH 4,5 và 22oBrix) Bã Ủ (24 giờ, ở nhiệt độ phòng)
Tạo khuẩn lạc trên đĩa petri (Môi trường PGA)
Tách ròng (Môi trường dinh dưỡng Sabouraud)
Trữ giống nấm men (Nhiệt độ 4 -10oC) Pha loãng
Sucrose, NaHCO3
ngày. Quan sát các khuẩn lạc hiện diện, dựa vào sự khác nhau về màu sắc, hình dạng, kích thước khuẩn lạc cũng như hình dạng, kích thước tế bào nấm men để phân loại các dòng nấm men khác nhau. Cấy chuyền nhiều lần từng dòng nấm men lên môi trường PGA cho đến khi đạt được các dòng nấm men thuần chủng. Khi cấy chuyền có thể áp dụng phương pháp cấy ria hoặc pha loãng khuẩn lạc trong nước cất tiệt trùng và cấy gạt. Khi đã thu được các dòng nấm men thuần chủng, làm tiêu bản giọt ép để chụp hình và đo kích thước tế bào. Pha loãng khuẩn lạc bằng nước cất tiệt trùng 2 lần và cấy gạt để tạo đĩa có khuẩn lạc tách rời nhau. Sau 48 giờ nuôi cấy quan sát hình dạng, màu sắc và đo kích thước khuẩn lạc.
Phương pháp chuẩn bị môi trường:
• PGA (Potato Glucose Agar): khoai tây 20%, glucose 2%, agar 2%, (NH4)2SO4 0,2%, KH2PO4 0,2%, nước vừa đủ 100%. Khoai tây xắt lát mỏng và luộc trong nước cất khoảng 10 phút. Sau đó, ta lọc lấy phần nước trong, cho agar, đường và khoáng vào khuấy đều, microwave dịch cho đến khi agar tan hết. Tiệt trùng môi trường ở 121oC trong 15 phút.
• Môi trường bảo quản giống: sử dụng môi trường Sabouraud tổng hợp, cân 65g môi trường trong 1 lít nước cất, phối trộn hòa tan với nhau, phân phối vào 1/3 thể tích ống nghiệm, khử trùng ở 115oC trong 10 phút, để nghiêng ống nghiệm tạo ống thạch nghiêng. Trữ nấm men ở 4-10oC, cấy chuyền 2 tháng/lần.
d. Chỉ tiêu theo dõi:
• Quan sát hình dạng, màu sắc, kích thước khuẩn lạc hiện diện trên môi trường dinh dưỡng bằng mắt thường.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Với đặc điểm phát triển khuẩn lạc trên môi trường PGA cho thấy sau lần cấy gạt đầu tiên chỉ có sự khác biệt rõ giữa khuẩn lạc nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Khuẩn lạc nấm mốc thường to có sợi lan mạnh và có màu đen, trắng...; khuẩn lạc vi khuẩn láng ướt, nhỏ, màu vàng, đỏ. Trong khi đó khuẩn lạc nấm men thường có màu trắng, tròn, trương cao, bề mặt trơn láng. Tuy nhiên khi chọn khuẩn lạc để cấy chuyền, không nên bỏ qua các khuẩn lạc có hình dạng đặc biệt như bề mặt sần khô, lan rộng thành một mảng lớn,... Sau khi khuẩn lạc trên các đĩa đã tương đối đồng đều, tiến hành quan sát tế bào nấm men dưới kính hiển vi để loại bớt các dòng giống nhau, chọn đĩa có ít dòng men lẫn vào nhau hơn để dễ tách ròng. Quan sát hình dáng tế bào và khuẩn lạc thường xuyên để tránh mất dòng.