L ỜI CẢM ƠN
3.5. Các bước và nội dung thực hiện
3.5.1. Các bước thực hiện
Mẫu sau khi đã được ly trích sẽ được bố trí chạy phản ứng RT-PCR và nested RT-PCR như sơ đồ:
Sơ đồ 3.2 Cách thực hiện chạy phản ứng RT-PCR và nested RT-PCR trong 3 nội dung.
Sử dụng RT-PCR với primer ORF6 để kiểm mẫu đối chứng và 20 mẫu thu
thập. Thực hiện phản ứng nested RT-PCR với primer ORF7 trên hai mẫu vaccine để
chuẩn hóa quy trình, sau đó mới sử dụng quy trình này kiểm tra 20 mẫu thu thập. Đặt gel vào dung dịch điện di TBE.
Trộn mẫu với dung dịch đặt mẫu
Đặt mẫu vào gel agarose đã được cho sẵn vào dung dịch điện di
Điện di với hiệu điện thế 85 V trong 35 phút
Quan sát kết quả bằng phần mềm Quantity one của công ty Biorad.
Mẫu huyết thanh
Ly trích RNA
Chạy RT-PCR với primer ORF6
Mẫu dương
Mẫu âm
Pha loãng để chạy kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của hai phương pháp
Kiểm tra lại bằng nested RT-PCR
Chạy nested RT-PCR với primer ORF7
3.5.2. Nội dung thực hiện
3.5. 2.1. Xác định sự nhiễm virus PRRS bằng phương pháp RT-PCR
Mẫu sau khi được ly trích RNA được sử dụng cho chạy phản ứng RT-PCR với
cặp mồi ORF6 (Bảng 3.1).Để thực hiện phản ứng phiên mã ngược và khuếch đại đoạn
cDNA sau phiên mã ngược với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chúng tôi thực hiện phương pháp RT-PCR một bước nhằm hạn chế sự lây nhiễm (Sơ đồ 3.3) .
Quy trình thực hiện :
Chẩn bị hỗn hợp cho phản ứng
QIAGEN One Step RT-PCR kit
Thành phần Liều lượng cho 1 phản ứng (µl)
Buffer PCR (5X) 4 MgCl2 (25mM) 0,7 dNTP’s (10mM mỗi loại) 0,7 Primer F (20µM) 0,4 Primer R (20µM) 0,4 Enzyme mix 0,8 RNA mẫu 5 H2O 8 Tổng 20
Thực hiện phản ứng PCR với Chu kỳ nhiệt:
1. 500C/30’;950C/15’ 2. 35 chu kỳ : 950C/10’’; 550C/30’’; 720C/20’’ 3. 720C/3’; 250C/30’’ 4. Giữ sản phẩm ở 4 0C/5’ Chạy sản phẩm PCR (gel 1,5 %, 85V, 35’) Đọc kết quả Sơ đồ 3.3 Sử dụng RT-PCR phát hiện virus PRRS trên heo.
Sản phẩm của quá trình phản ứng sẽ được điện di trên gel agarose nồng 1,5 %
và đọc kết quả bằng hệ thống máy và Gel Doc của Bio-rad. Kết quả được quan sát trên gel với ladder (thang chẩn) kích thước 100 bp và so sánh với mẫu đối chứng. Mẫu dương tính khi sản phẩm có băng khoảng 508 bp trên gel đối với kiểu gene Châu Mỹ
và băng khoảng 485 bp đối với kiểu gene Châu Âu. Các chỉ tiêu theo dõi đó là tỷ lệ
nhiễm virus PRRS trong huyết thanh.
3.5.2.2. Xác định sự nhiễm virus PRRS và phân biệt các kiểu gene bằng phương pháp nested RT-PCR
Phương pháp nested RT-PCR gồm hai bước là chạy RT-PCR với đoạn mồi bên ngoài và tiếp tục dùng sản phẩm vừa chạy chạy PCR với đoạn mồi đặc hiệu bên trong. Trong đề tài, bước 1 là chạy RT-PCR với cặp outer primer (Mardassi và ctv, 1994) theo quy trình bộ kit Qiagen OneStep RT-PCR (Đức) khuếch đại vùng trình tự chung của hai kiểu gene virus. Thực hiện phản ứng với tất những mẫu đã ly trích RNA với thành phần phản ứng ở bảng 3.3 và chu kì nhiệt ở bảng 3.4. Sản phẩm
khuếch đại có kích thước khoảng 433 bp.
Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng RT-PCR
Thành phần của phản ứng
Nồng độ đầu Nồng độ cuối
Liều lượng cho 1 phản ứng (µl)
Buffer (5X)
dNTP’s (10mM cho mỗi loại)
Primer F1 (10 µM) Primer R1 (10 µM) Buffer (1X) dNTP’s(0,4mMmỗi loại) Primer F1 (0,6µM) Primer R1 (0,6µM) RNA mẫu (1 pg – 2 μg/phản ứng) H2O không Rnase Enzyme Mix (2 µl/50 µl phản ứng) Tổng 4 0,8 1,2 1,2 5 7 0,8 20
Cặp Primer F1 và R1 khuếch đại đoạn chung của hai kiểu gene Châu Âu và Châu Mỹ.
Bảng 3.4 Quy trình nhiệt theo bộ kit Qiagen OneStep RT-PCR
Bước Hoạt động Nhiệt độ (oC) Thời gian
Reverse transcription 50 30 phút Tiền biến tính 95 Biến tính 94 Bắt cặp 58 Kéo dài 72 15 phút 1 phút 1 phút 1 phút Lặp lại bước 3 đến bước 5 trong 30 chu kì 1 2 3 4 5 6 7 8 Hoàn thành Giữ sản phẩm 72 4 10 phút
Bước thứ 2 dùng sản phẩm của quy trình RT-PCR để tiếp tục chạy PCR với cặp inner primer (Pesch, 2003) được thiết kế dựa vào vùng trình tự ORF7 có khả năng
khuếch đại đặc hiệu một đoạn gene có kích thước khoảng 241 bp và 337 bp đối với
nhóm virus PRRS kiểu gene Châu Âu và Châu Mỹ tương ứng. Thực hiện phản ứng
PCR theo bộ kit Promega Taq (Promega) với thành phần phản ứng ở bảng 3.5 và chu kì nhiệt ở bảng 3.6.
Bảng 3.5 Liều lượng cho các thành phần của phản ứng nested-PCR
Thành phần
Nồng độ đầu Nồng độ cuối
Liều lượng cho 1 phản ứng (µl)
PCR buffer (5X) MgCl2 (25 mM)
dNTP’s(10mM cho mỗi loại)
PCR buffer (1X) MgCl2 (2,5 mM) dNTP’s(0,2 mM mỗi loại) 4 2 2 Primer F2 hoặc F3 (10 µM) Primer F2 hoặc F3(0,5 µM) 1 Primer R2 hoặc R3 (10 µM) Primer R2 hoặc R3 (0,5 µM) 1 Taq enzyme (5U/l ) Taq enzyme (0,5 U)
Mẫu RNA của sản phẩm RT-PCR H2O Tổng 0,1 1 8,9 20
Kiểu gene Châu Mỹ: Dùng cặp primer F2 và R2; Kiểu gene Châu Âu: Dùng cặp primer F3 và R3.
Chu kì nhiệt cho phản ứng nested-PCR:
Bảng 3.6 Chu kì nhiệt cho nested-PCR (Promega)
Bước Hoạt động Nhiệt độ (oC) Thời gian
1 Tiền biến tính 95 Biến tính 95 Bắt cặp 58 Kéo dài 72 2 phút 20 giây 40 giây 21 giây Lặp lại bước 2 đến bước 4 trong 25 chu kì 2 3 4 5 6 7 Hoàn thành Giữ sản phẩm 72 4 5 phút
Điện di sản phẩm trên gel agarose (1,5 %) với hiệu diện thế 85 V trong 35 phút.
Sau đó nhuộm, rửa gel và chụp gel bằng phần mềm Quality One của Biorad. So sánh kết quả với ladder 100 bp và mẫu đối chứng. Mẫu có băng 433 bp và có thêm băng
241 bp thì nhiễm virus PRRS kiểu gene Châu Âu. Còn mẫu có băng 433 bp và 337 bp là mẫu nhiễm virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ. Mẫu có băng 433 bp và có thêm băng
241 bp và 337 bp là mẫu nhiễm cả hai kiểu gene. Mẫu không xuất hiện hay xuất hiện băng không phù hợp với mẫu đối chứng là mẫu âm tính.
Chỉ tiêu theo dõi: Kết quả xuất hiện băng trên hai mẫu vaccine. Tỉ lệ nhiễm
3.5.2.3. So sánh độ nhạy và đặc hiệu của phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR trong phát hiện virus PRRS trên heo
Lấy 6 mẫu có kết quả dương tính ở nội dung 1 được pha loãng thành các nồng độ khác nhau sử dụng cho phản ứng RT-PCR với cặp primer ORF6 và đồng thời cho
phản ứng nested RT-PCR với cặp primer ORF7 (Sơ đồ 3.4). Thực hiện kiểm chứng
với nhiều mẫu dương pha loãng.
Sơ đồ 3.4 Cách thực hiện sánh độ nhạy của phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR.
Ngoài ra, chúng tôi còn kiểm tra 8 mẫu âm tính ở nội dung 1 bằng nested RT-PCR
để kiểm tra độ nhạy của phương pháp này trong phát hiện mẫu âm tính giả (Sơ đồ 3.5).
Sơ đồ 3.5 Cách thực hiện kiểm tra độ nhạy của phương nested RT-PCR.
Điện di sản phẩm để xem kết quả trên gel để so sánh độ nhạy của hai phương
pháp phát hiện được RNA của virus. Kích thước sản phẩm virus PRRS kiểu gene
Châu Mỹ hay châu Âu phải tương ứng với kiểu gene đó khi đối chiếu với ladder
100 bp và mẫu đối chứng.
Tỉ lệ phát hiện virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ hay châu Âu của từng phương
pháp trong mẫu dương. Tỉ lệ phát hiện virus PRRS trong những mẫu âm đã kiểm tra
bằng phương pháp RT-PCR sử dụng primer ORF6 của phương pháp nested RT-PCR.
3.6. Xử lý số liệu
Tỷ lệ nhiễm được trình bày theo tỷ lệ và khoảng tin cậy của tỷ lệ.
Sử dụng trắc nghiệm chi bình phương của phần mềm Statgraphic 7.0 để so sánh các tỷ lệ.
Mẫu dương tính với
cả hai phương pháp
Pha loãng
Mẫu ân tính với RT-PCR sử dụng primer ORF6
Kiểm tra lại bằng nested RT-PCR với Primer ORF7
Chạy RT-PCR sử dụng
primer ORF6 và nested RT-PCR với primer ORF7
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả xác định sự nhiễm virus PRRS trên heo bằng phương pháp RT-PCR
Khi sử dụng phương pháp RT-PCR với primer ORF6 để kiểm tra các mẫu RNA
ly trích từ những mẫu máu heo nghi ngờ nhiễm thu thập ở các trại heo. Kết quả cho
thấy có 12/20 (60 %) mẫu có kết quả dương tính và 8/20 (40 %) mẫu có kết quả âm tính (Bảng 4.1). Kết quả này cũng phụ hợp với Trần Thị Ánh Hồng (2007) khi tác giả
sử dụng RT-PCR với primer ORF6 để phát hiện virus PRRS (Hình 4.1).
Hình 4.1 Kết quả phát hiện virus PRRS trong huyết thanh của heo bằng RT-PCR. Giếng 1
và 2: Mẫu 1 và 5 (âm tính); Giếng 3 và 4: Mẫu 20 và 21 (dương tính); Giếng 5: DC(+): Đối
chứng dương; Giếng 6: Lad (Thang chẩn 100bp); Giếng 7: DC(-): Đối chứng âm; Giếng 8
và 9: Mẫu 23 và 24 (âm tính); Giếng 10, 11 và 12: Mẫu 27, 28 và 82 (dương tính).
Khi sử dụng phương pháp RT-PCR với primer ORF6 để phát hiện
RNA của virus PRRS thì khó phân biệt được mẫu nào nhiễm kiểu gene nào. Sản
phẩm khuếch đại cho kiểu gene Châu Mỹ là khoảng 508 bp và cho kiểu gene
Châu Âu là khoảng 485 bp, vì thế rất khó khăn khi xác định hai kiểu gene virus PRRS trên gel. Đây cũng là nhược điểm khi sử dụng phương pháp RT-PCR với
primer ORF6 trong phát hiện virus PRRS. Ngoài ra, sản phẩm phụ tạo ra còn nhiều khi sử dụng phương pháp RT-PCR với primer ORF6. Điều này hay xảy ra
khi thực hiện phản ứng PCR, có thể là do độ đặc hiệu của mồi hay nồng độ một số
chất chưa thật sự tối ưu trong phản ứng. Tuy nhiên, sản phẩm phụ có kích thước
nhỏ hơn 100 bp nên có thể sử dụng phương pháp RT-PCR với primer ORF6 này
để phát hiện RNA của virus PRRS trong mẫu…
Bảng 4.1 Kết quả phát hiện RNA của virus PRRS của phương pháp RT-PCR với primer ORF6
Kết quả Số mẫu Tỉ lệ (%) Dương tính Âm tính Tổng 12 8 20 60 40 100
4.2. Kết quả xác định sự nhiễm và phân biệt hai kiểu gene virus PRRS bằng phương pháp nested RT-PCR.
Với 2 mẫu vaccine được kiểm tra bằng nested RT-PCR để chuẩn hóa qui
trình đã cho băng tương ứng với virus PRRS kiểu gene Châu Âu là khoảng 241 bp
và với virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ là khoảng 337 bp. Trên gel xuất hiện băng
khoảng 337 bp đối với mẫu vaccine Besta và xuất hiện cả hai băng khoảng 337 bp và băng 241 bp đối với vaccine Porcillis. Kết quả thu được đúng theo nhà cung cấp
với mẫu vaccine Besta nhiễm virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ và mẫu vaccine
Porcillis nhiễm cả hai kiểu gene (Hình 4.2). Kết quả thực hiện trong hai mẫu
vaccine cho thấy có thể sử dụng quy trình nested RT-PCR với thành phần phản ứng
và trình nhiệt đã nêu để phát hiện virus PRRS.
Hình 4.2 Kết quả phát hiện virus PRRS trong mẫu vaccine
bằng nested RT-PCR. Be: Vaccine Besta; LAD: thang chuẩn 100 bp;
Por: Vaccine Porcillis.
500 bp
337 bp 241 bp
Những mẫu đã ly trích kiểm tra bằng phương pháp RT-PCR với primer
ORF6 được kiểm tra sự nhiễm virus PRRS bằng phương pháp nested RT-PCR với primer ORF7 của Pesch (2003). Với phương pháp nested RT-PCR đã phát hiện được 18/20 (90 %) mẫu dương tính và 2/20 (10 %) mẫu có kết quả âm tính (Bảng 4.2). Trong đó, số mẫu nhiễm kiểu gene Châu Mỹ là 10/18 (55,56 %) mẫu, số mẫu nhiễm kiểu gene Châu Âu là 2/18 (11,11 %) mẫu và số mẫu nhiễm cả hai kiểu gene là 6/18 (33,33 %) mẫu. Phương pháp nested RT-PCR đã phát hiện và phân biệt được hai kiểu gene virus PRRS trong mẫu thu thập (Hình 4.3).
Hình 4.3 Kết quả phát hiện virus PRRS trong huyết thanh heo bằng nested RT-PCR.
O: Outer (Đoạn chung); EU: Kiểu gene Châu Âu; US: Kiểu gene Châu Mỹ; Lad: Thang
chẩn 100 bp; a) Mẫu 3 và 28: Nhiễm kiểu gene Châu Mỹ, DC (-): Mẫu đối chứng âm, mẫu
25 và 25: Nhiễm kiểu gene Châu Âu; b) Mẫu 22: Nhiễm kiểu gene Châu Âu, mẫu 23: Nhiễm
cả hai kiểu gene; c) Mẫu T5: Nhiễm cả hai kiểu gene, mẫu 26:Nhiễm kiểu gene Châu Mỹ,
DC(+): Mẫu đối chứng dương.
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của U. Truyen và ctv (2006) khi tác giả sử dụng đoạn outer primer của Mardassi và ctv (1994) và inner primer của Pesch và
ctv (2003) để phát hiện và phân biệt hai kiểu gene virus PRRS trên máu của heo nghi
ngờ nhiễm virus PRRS. a) b) c) 3 DC (-) Lad 25 O EU US O EU US O EU US 500 bp T5 26 Lad DC (+) O EU US O EU US O EU US US O EU US 22 23 Lad 28 O EU US O EU US O EU US US uÚUUS 433 bp 241bp 337 bp
Bảng 4.2 Kết quả phát hiện RNA của virus PRRS
bằng phương pháp nested RT-PCR với primer ORF7
Kết quả Số mẫu Tỉ lệ (%) Dương tính Âm tính Tổng 18 2 20 90 10 100
Bảng 4.3 Kết quả phân biệt hai kiểu gene của virus PRRS bằng
phương pháp nested RT-PCR trong mẫu dương tính
Mẫu nhiễm
Kiểu gene Kiểu gene Cả hai Tổng
Châu Mỹ Châu Âu kiểu gene
Số mẫu (Tỉ lệ %)
10 (55,56 %) 2 (11,11 %) 6 (33,33 %) 18 (100 %)
Theo bảng số liệu của bảng 4.3 thì khi sử dụng phương pháp nested RT-PCR đã phân biệt được các mẫu nhiễm các kiểu gene virus PRRS. Trong đó, mẫu nhiễm kiểu gene
Châu Mỹ chiếm chủ yếu, mẫu nhiễm kiểu gene Châu Âu rất ít. Kết quả phân biệt các kiểu
gene của virus PRRS phù hợp với Trần Thị Dân và ctv (2007) khi tác giả sử dụng phương
pháp ELISA phát hiện và phân biệt cả hai kiểu gene virus này tại một số cơ sở chăn nuôi
heo miền Đông Nam Bộ trên heo nghi ngờ nhiễm phát hiện 36,78 % và có 85,71 % số cơ
sở chăn nuôi bị nhiễm. Trên các mẫu nhiễm có 59,23 % số mẫu nhiễm kiểu gene Châu Mỹ, 3,8 % số mẫu nhiễm kiểu gene Châu Âu và 36,92 % số mẫu nhiễm cả kiểu gene.
4.3. Kết quả so sánh độ nhạy và đặc hiệu của phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR trong phát hiện virus PRRS trên heo.
Độ nhạy của hai phương pháp PCR được kiểm tra với nhiều mẫu dương tính với virus PRRS được pha loãng bậc 10 đã cho các kết quả khác nhau (Bảng 4.4).
Bảng 4.4 Kết quả so sánh độ nhạy của hai phương pháp
trong phát hiện virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ
Mức phát hiện Mẫu RT-PCR Nested RT-PCR 3 4 22 T3 T4 T5 10-3 10-3 10-4 10-5 10-4 10-4 10-8 10-7 10-8 10-8 10-6 10-6
Kết quả của hai phương pháp được kiểm tra trên gel agarose 1,5 % đã cho
băng sản phẩm có kích thước khoảng 508 bp tương ứng với primer ORF6 và băng
khoảng 337 bp tương úng với primer ORF7 của Pesch trong mẫu nhiễm kiểu gene
virus Châu Mỹ Sản phẩm của nested RT-PCR có độ nhạy và độ đăc hiệu hơn phương pháp RT-PCR (Hình 4.4).
Hình 4.4 Độ nhạy của RT-PCR và nested RT-PCR trong phát hiện virus PRRS kiểu
gene Châu Mỹ. Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: mẫu được phát hiện bằng RT-PCR; Giếng 10
là ladder; Giếng 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19: mẫu được phát hiện bằng nested RT-PCR.
Từ số liệu của bảng 4.4 cho thấy phương pháp nested RT-PCR có thể phát hiện được mẫu có nồng độ pha loãng thấp tốt hơn phương pháp RT-PCR. Kết quả này cũng
phù hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả (Fetzer và ctv, 2006; U. Truyen và ctv, 2006) khi sử dụng quy trình nested RT-PCR với primer thiết kế của Mardassi và Pesch để
kiểm tra độ nhạy của phương pháp này. Kết quả so sánh độ nhạy giữa hai phương
pháp RT-PCR và nested RT-PCR cũng phù hợp với nghiên cứu của Lo và cộng sự.
Tác giả đã chỉ ra độ nhạy của phương pháp nested-PCR là hơn phương pháp PCR thông thường 10.000 lần. Phương pháp nested-PCR là phương pháp nhanh và tin tưởng để kiểm tra sản phẩm PCR.
Kiểm tra lại 8 mẫu âm tính của phương pháp RT-PCR với đoạn primer
ORF6 bằng phương pháp nested RT-PCR với primer ORF7 cho kết quả 6/8 mẫu dương tính. Kết quả cho thấy sử dụng kỹ thuật nested RT-PCR là cần thiết trong chẩn đoán virus PRRS, cho phép phát hiện những mẫu âm tính giả (Hình 4.5).
508 bp 337 bp
100 10-1 10-2 10-3 10-410-5 10- 10-710-8 Lad 100 10-1 10-2 10-310-4 10-5 10-6 10-7 10-8