L ỜI CẢM ƠN
4.1.Kết quả xác định sự nhiễm virus PRRS trên heo bằng phương pháp RT-PCR
Khi sử dụng phương pháp RT-PCR với primer ORF6 để kiểm tra các mẫu RNA
ly trích từ những mẫu máu heo nghi ngờ nhiễm thu thập ở các trại heo. Kết quả cho
thấy có 12/20 (60 %) mẫu có kết quả dương tính và 8/20 (40 %) mẫu có kết quả âm tính (Bảng 4.1). Kết quả này cũng phụ hợp với Trần Thị Ánh Hồng (2007) khi tác giả
sử dụng RT-PCR với primer ORF6 để phát hiện virus PRRS (Hình 4.1).
Hình 4.1 Kết quả phát hiện virus PRRS trong huyết thanh của heo bằng RT-PCR. Giếng 1
và 2: Mẫu 1 và 5 (âm tính); Giếng 3 và 4: Mẫu 20 và 21 (dương tính); Giếng 5: DC(+): Đối
chứng dương; Giếng 6: Lad (Thang chẩn 100bp); Giếng 7: DC(-): Đối chứng âm; Giếng 8
và 9: Mẫu 23 và 24 (âm tính); Giếng 10, 11 và 12: Mẫu 27, 28 và 82 (dương tính).
Khi sử dụng phương pháp RT-PCR với primer ORF6 để phát hiện
RNA của virus PRRS thì khó phân biệt được mẫu nào nhiễm kiểu gene nào. Sản
phẩm khuếch đại cho kiểu gene Châu Mỹ là khoảng 508 bp và cho kiểu gene
Châu Âu là khoảng 485 bp, vì thế rất khó khăn khi xác định hai kiểu gene virus PRRS trên gel. Đây cũng là nhược điểm khi sử dụng phương pháp RT-PCR với
primer ORF6 trong phát hiện virus PRRS. Ngoài ra, sản phẩm phụ tạo ra còn nhiều khi sử dụng phương pháp RT-PCR với primer ORF6. Điều này hay xảy ra
khi thực hiện phản ứng PCR, có thể là do độ đặc hiệu của mồi hay nồng độ một số
chất chưa thật sự tối ưu trong phản ứng. Tuy nhiên, sản phẩm phụ có kích thước
nhỏ hơn 100 bp nên có thể sử dụng phương pháp RT-PCR với primer ORF6 này
để phát hiện RNA của virus PRRS trong mẫu…
Bảng 4.1 Kết quả phát hiện RNA của virus PRRS của phương pháp RT-PCR với primer ORF6
Kết quả Số mẫu Tỉ lệ (%) Dương tính Âm tính Tổng 12 8 20 60 40 100
4.2. Kết quả xác định sự nhiễm và phân biệt hai kiểu gene virus PRRS bằng phương pháp nested RT-PCR.
Với 2 mẫu vaccine được kiểm tra bằng nested RT-PCR để chuẩn hóa qui
trình đã cho băng tương ứng với virus PRRS kiểu gene Châu Âu là khoảng 241 bp
và với virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ là khoảng 337 bp. Trên gel xuất hiện băng
khoảng 337 bp đối với mẫu vaccine Besta và xuất hiện cả hai băng khoảng 337 bp và băng 241 bp đối với vaccine Porcillis. Kết quả thu được đúng theo nhà cung cấp
với mẫu vaccine Besta nhiễm virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ và mẫu vaccine
Porcillis nhiễm cả hai kiểu gene (Hình 4.2). Kết quả thực hiện trong hai mẫu
vaccine cho thấy có thể sử dụng quy trình nested RT-PCR với thành phần phản ứng
và trình nhiệt đã nêu để phát hiện virus PRRS.
Hình 4.2 Kết quả phát hiện virus PRRS trong mẫu vaccine
bằng nested RT-PCR. Be: Vaccine Besta; LAD: thang chuẩn 100 bp;
Por: Vaccine Porcillis. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
500 bp
337 bp 241 bp
Những mẫu đã ly trích kiểm tra bằng phương pháp RT-PCR với primer
ORF6 được kiểm tra sự nhiễm virus PRRS bằng phương pháp nested RT-PCR với primer ORF7 của Pesch (2003). Với phương pháp nested RT-PCR đã phát hiện được 18/20 (90 %) mẫu dương tính và 2/20 (10 %) mẫu có kết quả âm tính (Bảng 4.2). Trong đó, số mẫu nhiễm kiểu gene Châu Mỹ là 10/18 (55,56 %) mẫu, số mẫu nhiễm kiểu gene Châu Âu là 2/18 (11,11 %) mẫu và số mẫu nhiễm cả hai kiểu gene là 6/18 (33,33 %) mẫu. Phương pháp nested RT-PCR đã phát hiện và phân biệt được hai kiểu gene virus PRRS trong mẫu thu thập (Hình 4.3).
Hình 4.3 Kết quả phát hiện virus PRRS trong huyết thanh heo bằng nested RT-PCR.
O: Outer (Đoạn chung); EU: Kiểu gene Châu Âu; US: Kiểu gene Châu Mỹ; Lad: Thang
chẩn 100 bp; a) Mẫu 3 và 28: Nhiễm kiểu gene Châu Mỹ, DC (-): Mẫu đối chứng âm, mẫu
25 và 25: Nhiễm kiểu gene Châu Âu; b) Mẫu 22: Nhiễm kiểu gene Châu Âu, mẫu 23: Nhiễm
cả hai kiểu gene; c) Mẫu T5: Nhiễm cả hai kiểu gene, mẫu 26:Nhiễm kiểu gene Châu Mỹ,
DC(+): Mẫu đối chứng dương.
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của U. Truyen và ctv (2006) khi tác giả sử dụng đoạn outer primer của Mardassi và ctv (1994) và inner primer của Pesch và
ctv (2003) để phát hiện và phân biệt hai kiểu gene virus PRRS trên máu của heo nghi
ngờ nhiễm virus PRRS. a) b) c) 3 DC (-) Lad 25 O EU US O EU US O EU US 500 bp T5 26 Lad DC (+) O EU US O EU US O EU US US O EU US 22 23 Lad 28 O EU US O EU US O EU US US uÚUUS 433 bp 241bp 337 bp
Bảng 4.2 Kết quả phát hiện RNA của virus PRRS
bằng phương pháp nested RT-PCR với primer ORF7
Kết quả Số mẫu Tỉ lệ (%) Dương tính Âm tính Tổng 18 2 20 90 10 100
Bảng 4.3 Kết quả phân biệt hai kiểu gene của virus PRRS bằng
phương pháp nested RT-PCR trong mẫu dương tính
Mẫu nhiễm
Kiểu gene Kiểu gene Cả hai Tổng
Châu Mỹ Châu Âu kiểu gene
Số mẫu (Tỉ lệ %)
10 (55,56 %) 2 (11,11 %) 6 (33,33 %) 18 (100 %)
Theo bảng số liệu của bảng 4.3 thì khi sử dụng phương pháp nested RT-PCR đã phân biệt được các mẫu nhiễm các kiểu gene virus PRRS. Trong đó, mẫu nhiễm kiểu gene
Châu Mỹ chiếm chủ yếu, mẫu nhiễm kiểu gene Châu Âu rất ít. Kết quả phân biệt các kiểu
gene của virus PRRS phù hợp với Trần Thị Dân và ctv (2007) khi tác giả sử dụng phương
pháp ELISA phát hiện và phân biệt cả hai kiểu gene virus này tại một số cơ sở chăn nuôi
heo miền Đông Nam Bộ trên heo nghi ngờ nhiễm phát hiện 36,78 % và có 85,71 % số cơ
sở chăn nuôi bị nhiễm. Trên các mẫu nhiễm có 59,23 % số mẫu nhiễm kiểu gene Châu Mỹ, 3,8 % số mẫu nhiễm kiểu gene Châu Âu và 36,92 % số mẫu nhiễm cả kiểu gene.
4.3. Kết quả so sánh độ nhạy và đặc hiệu của phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR trong phát hiện virus PRRS trên heo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Độ nhạy của hai phương pháp PCR được kiểm tra với nhiều mẫu dương tính với virus PRRS được pha loãng bậc 10 đã cho các kết quả khác nhau (Bảng 4.4).
Bảng 4.4 Kết quả so sánh độ nhạy của hai phương pháp
trong phát hiện virus PRRS kiểu gene Châu Mỹ
Mức phát hiện Mẫu RT-PCR Nested RT-PCR 3 4 22 T3 T4 T5 10-3 10-3 10-4 10-5 10-4 10-4 10-8 10-7 10-8 10-8 10-6 10-6
Kết quả của hai phương pháp được kiểm tra trên gel agarose 1,5 % đã cho
băng sản phẩm có kích thước khoảng 508 bp tương ứng với primer ORF6 và băng
khoảng 337 bp tương úng với primer ORF7 của Pesch trong mẫu nhiễm kiểu gene
virus Châu Mỹ Sản phẩm của nested RT-PCR có độ nhạy và độ đăc hiệu hơn phương pháp RT-PCR (Hình 4.4).
Hình 4.4 Độ nhạy của RT-PCR và nested RT-PCR trong phát hiện virus PRRS kiểu
gene Châu Mỹ. Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: mẫu được phát hiện bằng RT-PCR; Giếng 10
là ladder; Giếng 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19: mẫu được phát hiện bằng nested RT-PCR.
Từ số liệu của bảng 4.4 cho thấy phương pháp nested RT-PCR có thể phát hiện được mẫu có nồng độ pha loãng thấp tốt hơn phương pháp RT-PCR. Kết quả này cũng
phù hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả (Fetzer và ctv, 2006; U. Truyen và ctv, 2006) khi sử dụng quy trình nested RT-PCR với primer thiết kế của Mardassi và Pesch để
kiểm tra độ nhạy của phương pháp này. Kết quả so sánh độ nhạy giữa hai phương
pháp RT-PCR và nested RT-PCR cũng phù hợp với nghiên cứu của Lo và cộng sự.
Tác giả đã chỉ ra độ nhạy của phương pháp nested-PCR là hơn phương pháp PCR thông thường 10.000 lần. Phương pháp nested-PCR là phương pháp nhanh và tin tưởng để kiểm tra sản phẩm PCR.
Kiểm tra lại 8 mẫu âm tính của phương pháp RT-PCR với đoạn primer
ORF6 bằng phương pháp nested RT-PCR với primer ORF7 cho kết quả 6/8 mẫu dương tính. Kết quả cho thấy sử dụng kỹ thuật nested RT-PCR là cần thiết trong chẩn đoán virus PRRS, cho phép phát hiện những mẫu âm tính giả (Hình 4.5).
508 bp 337 bp
100 10-1 10-2 10-3 10-410-5 10- 10-710-8 Lad 100 10-1 10-2 10-310-4 10-5 10-6 10-7 10-8
Hình 4.5 Độ nhạy của phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR trong phát hiện
virus PRRS. O: outer (Đoạn chung); EU: kiểu gene Châu Âu; US: kiểu gene Châu Mỹ; Giếng
1, 2, 3 và 4: mẫu 19, 21, 25 và 29 (Mẫu cho kết quả âm tính với RT-PCR); Giếng 5: Lad (Thang
chẩn); Giếng 6, 7, 8: mẫu 19, giếng 9, 10, 11: mẫu 21, giếng 12, 13, 14: mẫu 25, giếng 15, 16,
17: mẫu 29 (Mẫu cho kết quả dương tính với nested RT-PCR).
Từ số liệu bảng 4.5 đã xử lý thống kê (P < 0,05) cho thấy là phương pháp
nested RT-PCR với primer ORF7 tốt hơn phương pháp RT-PCR với primer
ORF6 trong phát hiện mẫu nhiễm virus PRRS (18/20 dương tính so với 12/20).
Kỹ thuật nested RT-PCR còn thể hiện ưu điểm trong chẩn đoán phân biệt kiểu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
gene virus PRRS nhiễm: Châu Âu hoặc Châu Mỹ.
Bảng 4.5 Kết quả phát hiện virus PRRS của phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR
Phương pháp nested RT-PCR được thực hiện có ưu điểm nhạy và đặc hiệu hơn phương pháp RT-PCR trong chuẩn đoán virus PRRS. Phương pháp nested RT-PCR còn mới mẻ chưa được áp dụng nhiều ở Việt Nam. Với những kết quả thực hiện trong đề tài và một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy có thể áp dụng phương pháp này trong chuẩn đoán
virus PRRS trên heo ở nước ta.
Kết quả RT-PCR Nested RT-PCR Tổng Dương tính 12 18 30 Âm tính 8 2 10 Tổng 20 20 40 Sai biệt thống kê P = 0,028 433 bp 500 bp 337 bp 241 bp
Chương 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Kỹ thuật nested RT-PCR sử dụng primer ORF7 có thể phát hiện và phân biệt
virus PRRS kiểu gene châu Âu và châu Mỹ với độ nhạy cao hơn khoảng 1.000 lần so
với kỹ thuật RT-PCR.
Độ nhạy của phương pháp nested RT-PCR và RT-PCR trong phát hiện virus
PRRS là tùy vào trong mẫu kiểm tra có nồng độ cao hay thấp RNA.
Có thể sử dụng kỹ thuật RT-PCR với primer ORF6 trong việc chẩn đoán
virus PRRS trên heo.
Quy trình RT-PCR với primer ORF6 chưa đặc hiệu nên còn thấy nhiều băng
sản phẩm phụ.
Phương pháp nested RT-PCR được sử dụng để kiểm tra lại những mẫu âm tính
của phương pháp RT-PCR.
5.2. Đề nghị
Ứng dụng phương pháp nested RT-PCR trong phát hiện và phân biệt hai kiểu
gene virus PRRS trên các mẫu thu thập khác (tinh dịch, gan, phổi, amidan, dịch
nuôi cấy tế bào).
Thực hiện kỹ thuật nested RT-PCR và RT-PCR ở độ pha loãng cao hơn để có
sự đánh giá chính xác hơn về độ nhạy của kỹ thuật nested RT-PCR.
Nghiên cứu thực hiện kỹ thuật nested RT-PCR và RT-PCR trên cùng một đoạn ORF6 để có sự đánh giá rõ hơn về 2 kỹ thuật nested RT-PCR và RT-PCR trong chẩn đoán virus PRRS.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương.1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục,
Thành phố Hồ Chí Minh, trang 190-199. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Nguyễn Ngọc Hải. 2007. Công nghệ sinh học trong thú y. Nhà xuất bản Nông Nghiệp,
trang 23-101.
3. Trần Thị Ánh Hồng. 2008. Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145
và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
4. Trần Thị Bích Liên và Trần Thị Dân. 2007. Xác định tỉ lệ nhiễm và chủng virus
PRRS tại một số cơ sở chăn nuôi heo miền Đông Nam Bộ. Tạp chí khoa học kỹ
thuật thú y số 6-2007, trang 5-9.
5. Trần Thị Bích Liên. 2008. Bệnh tai xanh trên heo. Nhà xuất bản Nông nghiệp
thành phố Hồ Chí Minh, trang 9-36.
6. Trần Đức Minh. 2006. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
(Bài dịch từ: Theriogenology 66).
7. Hoàng Văn Năm. 2001. Hội chứng sinh sản và hô hấp ở lợn (bài dịch tổng hợp).
Tạp chí khoa học thú y, trang 74-87.
8. Nguyễn Nhất Bảo Quốc. 2005. Ứng dụng kĩ thuật RT-PCR để phát hiện virus
gây hội chứng rối loạn và sinh sản và hô hấp ở lợn. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư
ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
9. Huỳnh Trọng Tiến. 2007. Phát hiện virus gây hội chứng gây rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS) bằng kĩ thuật RT-PCR. Luận văn thạc sĩ, trường Đại học
Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại học Nông Lâm,
Tp. Hồ Chí Minh.
10. Võ Ngọc Thơ. 2007. Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT - PCR. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh.
11. Võ Thị Đan Thanh. 2006. Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145
và xác định virus bằng phương pháp RT-PCR. Luận văn tốt nghiệp bác sĩ thú y
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
12. Ausvetplan. 2004. Disease stratery porcine reproductive and respiratory syndrome. http://www.aahc.com.au/ausvetplan/index.htm.
13. C.Fetzer, S. Pesch, V.F. Ohlinger. 2006. High risk of false positive results in a widely used diagnostic test for detection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Veterinary Microbiology.115: 21-31.
14. Benfield DA, Nelson JK, Rossow KR, Nelson C, Steffen M, Rowland RR. 1999. Diagnosis of persistent or prolonged porcine reproductive and respiratory syndrome virus infections. Proc 3rd Symp PRRS and Aujeszky's Dis. Ploufragan, France, 151-152.
15. Davidson. 2002. Nested Primers for PCR.
16. Wagstrom, E. A., K. J. Yoon, C. Cook, and J. J. Zimmerman. 2000. Diagnostic performance of a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) test to detect porcine reproductive and respir-atory syndrome virus. J. Vet. Diag. Invest. 12: 75–78.
17. Wagstrom, E. A., C. C. Chang K. J. Yoon. J. J. Zimmerman. 2001. Shedding of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in mammary gland secretions of sows. Am. J. Vet. Res. 62: 1876-1880.
18. Fun In Wang. 1994. Minimal residues of porcine reproduction and respiratory syndrome virus in pig carcases and boar semen. Proc. Natl. Sci. counc ROC(B). 33: 167-174. 19. Mardassi H, Mounir S, Dea S. 1994. Identification of major differences in the (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nucleocapsid protein genes of a Quebec strain and European strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Gen. Virol. 75:681–685.
20. Han-Kook Chung, Changsun Choi, Junghyun Kim, Chanhee Chae. 2002. Detection and differentiation of North American and European genotypes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by multiplex reverse transcription-nested polymerase chain reaction. Vet. Diagn. Invest. 14:56–60.
21. Christopher-Hennings, J., E. A. Nelson, J. K. Nelson, R. J. Hines, S. L.Swenson, H. T. Hill, J. J. Zimmerman, J. B. Katz, M. J. Yaeger, C. C. L.Chase, and D. A. Benfield. 1995. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome vi-rus in boar semen by PCR. J. Clin. Microbiol. 33:1730–1734.
22. Zimmerman J, Benfield DA, Murtaugh MP, et al. 2006. Porcine reproductive and
respiratory syndrome virus (Porcine arterivirus). In: Diseases of swine, ed. Straw
23. Meulenberg Janneke J.M., 2000. PRRS, the virus. http//www.csirus.com.
24. Yoon, K.J., J.J. Zimmerman, S.L. Swenson, M.J. McGinley, K.A. Eernisse, A. Brevik, L.L. Rhinehart, M.L. Frey, H.T. Hill, and K.B. Platt. 1995. Characterization of the humoral immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus infection. J. Vet. Diagn. Invest. 7:305-312.
25. Yoon K.J.,and Stevenson G. 1999. Porcine reproductive and respiratory syndrome. Trends in emerging viral infection of swine. Iowa State Press. 347- 354.
26. Bierk, M. D., S. A. Dee, K. D. Rossow, J. E. Collins, M. I. Guedes, and T. W.
Molitor. 2000. Experiences with tonsil biopsy as an antemortem diagnostic test for detecting porcine reproductive and respiratory syndrome virus in-fection in breeding swine. Swine Health Prod. 8:279–282.
27. Delputte, P. L., Vanderheijden, N., Nauwynck, H. J. & Pensaert, M. B. 2002. Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolar macrophages. J. Virol. 76: 4312–4320.
28. R.Allende, W.W.Laegreid, G.F.Kutish, J.A.Galeota, R.W.Wills and F.A.Osorio. 2000. Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus: Description Of Persistence In Individual Pigs Upon Experimental Infection. Journal of Virology. 10834–10837.
29. Pesch. S. 2003. Etablierung einer Nachweismethode fur die zwei Genotypen von PRRSV und ein Beitrag zu seiner molekularen Epidemiologie. Doctoral Vet. Med.