Sau khi thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 261F/261R, 15 μl sản phẩm khuếch đại của mẫu tôm nghi ngờ nhiễm MBV được lấy từ Cần Giờ được giải trình tự 2 chiều với cặp mồi 261F/261R tại công ty Nam Khoa (793/58 Trần Xuân Soạn, quận 7, TP. Hồ Chí Minh). Kết quả giải trình tự được xem và xử lý bằng phần mềm BioEdit. Trình tự DNA được so sánh với các trình tự khác đã được công bố trên ngân hàng gen của NCBI bằng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov) để xác định mức độ tương đồng và khẳng định sản phẩm khuếch đại là trình tự của MBV.
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Ly trích DNA từ mẫu gan tôm
DNA tổng số được ly trích từ mẫu gan tôm và mẫu tôm post theo quy trình của Caipang và ctv (2004) đã được cải biến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Hình 4.1 Kết quả ly trích DNA tổng số từ mẫu gan tôm
Kết quả (hình 4.1) cho thấy các băng DNA tổng số xuất hiện rõ và đồng đều ở các mẫu, tuy nhiên băng điện di vẫn có vệt smear, điều này có thể giải thích là do lượng DNA bị đứt gãy và protein tạp chưa được loại bỏ hoàn toàn. Kết hợp với việc đo OD để kiểm tra độ tinh sạch DNA ly trích, kết quảđo OD (bảng 4.1, bảng 4.2) thể hiện với 2 chỉ số là A260/280 đặc trưng lượng protein tạp còn trong dịch ly trích và A230/260 đặc trưng cho hàm lượng phenol trong quá trình ly trích còn tồn dư, thông qua 2 chỉ số này cho thấy hầu hết các mẫu DNA ly trích đều tinh sạch, nằm trong khoảng cho phép (1,8 - 2 đối với chỉ số A260/280 và xấp xỉ 2 đối với chỉ số A260/230) nên có thể dùng làm DNA khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR. Do vậy, quy trình ly trích đã nghiên cứu có khả năng áp dụng để thu DNA tổng số trong phát hiện bệnh tôm MBV tại Việt Nam.
Bảng 4.1 Kết quảđo OD của mẫu DNA ly trích từ gan tôm
Mẫu Nồng độ DNA OD260 nm/OD280 nm OD260nm/OD230nm
1 4.700 1,922 2,027 2 5.855 1,806 1,857 3 4.288 1,927 2,043 4 2.501 1,857 1,979 5 1.377 1,937 1,926 6 4.987 1,822 1,668 7 3.575 1,833 1,804 8 4.166 1,893 1,632
Bảng 4.2 Kết quảđo OD của mẫu DNA ly trích từ tôm post
Mẫu Nồng độ DNA OD260nm/OD280nm OD260nm/OD230nm
1 4.215 1,988 2,087
2 5.828 1,780 1,407
3 2.970 2,007 1,755
4 5.796 1,769 1,459
5 3.489 2,001 1,673
Tuy nhiên có thể áp dụng một số quy trình ly trích khác hoặc tối ưu nồng độ các chất sử dụng để tăng lượng DNA và tăng độ tinh sạch của DNA sử dụng trong phản ứng PCR.