Để xác định hoạt tính kháng nguyên, chúng tôi tiến hành kích thích tế bào tại các nồng độ kháng nguyên khác nhau. Mức độ đáp ứng được đo bằng nồng độ INF gamma thu được trong nước nổi nuôi cấy tế bào.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.4; hình 3.13.
24.8 kDa
24.8 kDa 25kDa
15kDa
Bảng 3.4. Đáp ứng với các nồng độ kháng nguyên khác nhau PHA* (10μg/ml) Nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp CFP10/ESAT6 (μg/ml) 0 2.5 5 10 20 Nồng độ INF gamma trên mẫu bệnh nhân lao(pg/ml)
850.7 14.6 268.4 397.7 446.1 457.7
Nồng độ INF gamma trên mẫu khỏe mạnh(pg/ml) Không xác định 30.9 34.7 38.4 47.4 44.6 * :PHA: Phytohemagglutinin
Hình 3.13. Đáp ứng tại các nồng độ kháng nguyên khác nhau (bệnh nhân lao) Kết quả ở bảng 4 và hình 3.13 cho thấy trên bệnh nhân lao, nồng độ INF gamma thu được tăng một cách đáng kể khi tăng nồng độ kháng nguyên kích thích tế bào từ 2,5 đến 10 μg/ml và ổn định ở nồng độ kháng nguyên 10-20 μg/ml (446pg/ml- 457pg/ml). Trên đối tượng khỏe mạnh âm tính với kít quantiferon, không có sự khác biệt khi tăng nồng độ kháng nguyên từ 0-20 μg/ml. Vì vậy, nồng độ kháng nguyên tối ưu được lựa chọn là 10μg/ml.
KẾT LUẬN
1. Thiết kế thành công vector biểu hiện mang gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6-CFP10.
2. Đã xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu để tăng khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp ở dạng hòa tan trong tế bào vi khuẩn ở điều kiện 280C, nồng độ IPTG 1mM và thời gian cảm ứng là 3 giờ.
3. Tinh sạch thành công protein tái tổ hợp ESAT6-CFP10 để sử dụng làm nguyên liệu tạo kit chẩn đoán nhiễm lao.
4. Xác định nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6-CFP10 sử dụng trong bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao là 10μg/ml.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu sự đáp ứng miễn dịch trong một số thể bệnh lao,
Luận án Tiến sỹ Sinh học.
2. Đặng Đức Anh, Hồ Minh Lý, Trần Thị Thanh Hoa, Hoàng Thị Minh Tú, Nguyễn Thị Nguyệt (2006), ″Giải trình tự và phân tích gen ESAT6 của
Mycobacterium tuberculosis phân lập từ bệnh nhân lao màng não″, Tạp chí
Y học dự phòng tập XVI, số 6(85), tr. 14-18.
3. Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi sinh vật y học, Học viện quân y.
4. Bộ Y tế.( 2012), Báo cáo tổng kết chương trình chống lao quốc gia 2012. 5. Bộ Y tế (2010), Chiến lược phòng chống lao quốc gia giai đoạn 2011-2015. 6. Bộ Y tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2005), Báo cáo tổng kết Chương
trình chống lao quốc gia 2005.
7. Lê Huy Chính (2001), Vi sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, Tr. 207-214.
8. Nguyễn Thị Chính, Trương Thị Hoà (2005), Vi sinh vật Y học, NXB Đại học
Quốc gia Hà Nội.
9. Chương Trình Chống Lao Quốc Gia (2011), Báo cáo tổng kết Chương trình
Chống lao Quốc gia năm 2010 và phương hướng hoạt động năm 2011.
10. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học,
NXB Giáo dục.
11. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2004), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục.
12. Phan Thị Thu Hương, Đỗ Quỳnh Nga, Vũ Tân Trào (2005), “Phát hiện
M. tuberculosis trong môi trường bệnh viện lao sử dụng kỹ thuật PCR”,
Hội nghị khoa học toàn quốc về công nghệ sinh học, Tháng 12/2005.
13. Nguyễn Văn Hưng (2001), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của
Mycobacterium tubeculosis phân lập tại Viện lao và Bệnh phổi, Luận án
Tiến sỹ Y học.
14. Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kĩ thuật di truyền và ứng dụng,
15. Lê Thị Luyến, Bộ Y tế (2007), Tình hình dịch tễ, điều trị, dự phòng và nghiên
cứu Lao tại Việt Nam, Hội thảo về sinh học phân tử về bệnh lao, Đại học
Quốc gia Hà Nội, Tháng 8/2007.
16. Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng và điều trị,
NXB Giáo dục.
17. Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ, Lê Quốc Tuấn (2007),
“Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình PCR đa mồi (multiplex PCR) dùng trong
chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao” Tạp chí Y học Việt Nam, 337(1), p.27-31. 18. Quyền Đình Thi (2005), Công nghệ sinh học, NXB Khoa học kỹ thuật.
19. Nguyễn Xuân Triều (2006), “Chẩn đoán lao”, Bài giảng Lao và Bệnh phổi sau
đại
học, Học Viện Quân Y.
20. Nguyễn Văn Việt (2011), ″Mycobacterium tuberculosis״, Vi sinh y học, NXB
Quân đội nhân dân, Hà Nội, Tr. 228 - 235. Tài liệu tiếng Anh
21. A.S.Mustafa., F. Oftung., H.A. Amoudy., N.M. Madi., A.T. Abal., F. Shaban., et
al. (2000), ″Multiple Epitopes from the Mycobacterium tuberculosis ESAT6 Antigen are recognized by antigen-Specific –Human T Cell Lines″,
Clinical Infectious Diseases, Vol. 30, S201-S205.
22. Ashtekar M.D. and Vidis S.S. (1993), ″T lymphocytes in pulmonary
tuberculosis,″ Indian J.Med.Res, 97, pp. 14-17.
23. Barrett-Connor E. (1979), "The epidemiology of tuberculosis in physicians,"
JAMA, 241, pp.33-38.
24. Behr MA., Wilson MA., Gill WP., Salamon H., Schoolnik GK., Rane S., et al. (1999), "Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA
microarray," Science 1999, 284(5419), 1520-1523.
25. Bluberg H. M., Watkins D. L., Berschling J.D. and Antle A. "Moore
26. Brosch R., G.S.V., Marmiesse M. and et al. (2002), "A new evolutionary
scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex," Proc Nalt Acad Sci
USA, 99, 3684-3689.
27. Capewell S., Leaker AR. and Leitch AG. (1988), "Pulmonary tuberculosis in
health service staff-is it still a problem," Tubercle, 69, pp. 113-118.
28. Collins D M , D M Stephens (1991), “Identification of an insertion sequence,
IS1081, in Mycobacterium bovis”, FEMS Microbiol Lett, 15(67), 11-15.
29. Cooper M.A., Dalton D. and Orme I.M. (1993), "Disseminated tuberculosis in
interferon gamma gene-disrupted mice," Jounal of Experimental Medicine
178, pp.2243-2247.
30. Ellner J.J. and Wallis R.S. (1989), "Immunologic aspects of mycobacterial
infections," Review of Infectious Diseases II, pp.S455-S459.
31. F.X. Berthet., P.B. Rasmussen., I. Rosenkrands., P. Andersen. And B. Gicquel. (1988), “A Mycobacterium tubersulosis operon encoding ESAT6 and a
novel lowmolecular-mass culture filtrate protein (CFP10),” Microbiology,
1443195e3203.
32. G.G. Mahairas., P.J.Sabo., M.J. Hickey., D.C. Singh. And C.K. Stover. (1996), ″Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis
BCG and virulent M.bovis″, J.Bacteriol, 178 1274e1282.
33. Gerston K.F. and et all. (2004), "Viability of Mycobacteria in the formalin-
Fixed Lungs," Hunman Pathology, 35, 571-575.
34. Gordon SV., Brosch R., Billault A., Garnier T., Eiglmeier K. and Cole ST. (1999), "Identification of variable regions in the genomes of tubercle bacilli
using bacterial artificial chromosome arrays," Mol Microbiol 1999, 32(3),
643-655.
35. Goyal et al (1996), “Rapid detection of multidrug – resistant tuberculosis”, Eur Respir, 1997, 10, p1120 – 1124.
et al. (2004), ″Individual RD1-region genes are required for export of
ESAT6/CFP10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis,″ Mol
Microbiol, 51, 359-370.
37. Gurpreet S. Sandhu, Bruce C. Kline, Glenn D. Roberts, Marcia E. Lewis (1998), “IS6110 based molecular detection of Mycobacterium tuberculosis”, United States Patent , 5731150
38. Herrera EA, Perez O, Segovia M. (1996), “Differentiation between
Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by a multiplex polymerase reaction”, Journal of Applied Bacteriology, 80, 596-604.
39. Hill PC., Jackson-SillahD., Fox A. and et al. (2005), ″ESAT6/CFP10 fusion protein
and peptide for optional diagnosis of mycobacterium tuberculosis infection
by ex vivo enzym-linked immunospot assay in Gambia,″ J Clin Microbiol,
43, 2070-2074.
40. Hsu T., Hingley-Wilson SM., Chen B., Chen M., Dai AZ., Morin PM., et al. (2003), "The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette- Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung
interstitial tissue," Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100, 12420-12425.
41. Jaber M., A. Rattan, A. Verma, J. Tyag F, R. Kumar (1995), “A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis”, Tubercle and Lung Disease, 76, 578-581
42. K.N. Lewis., R.Liao.,K.M. Guinn., M.J.Hickey., S. Smith. And M.A.Behr
D.R.S. (2003), ″Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmettee- Guein attenuation,″ J. Infec. Dis., 187, 117e123.
43. Kremer L. and B.G. (2005), "A waxy tale - by Mycobacterium tuberculosis," In
Tuberculosis and the Tubercle bacillus. ASM Press, Washington DC,
44. Kurabachew M., Sandaad R. A., Engere, Bjorvatna B., (2003), “Sequence analysis in the 23S rDNA region of Mycobacterium tuberculosis and related species”, Journal of Microbiological Methods, 54, 373 - 380. 45. Lazraq R, el Baghdadi J, Guesdon JL, Benslimane A. (1999), “Evaluation of
IS6110 as amplification target for direct tuberculosis diagnosis”, Pathologie Biologie, 47(8):790-6
46. L. Brant., T. Oettinger., A.Holm., A.B. Anderson. And P. Andersen.(1996), ″Key epitopes on the ESAT6 antigen recognize in mice during the recall of
protective immunity to Mycobacterium tuberculosis,″ J. Immunol., 157,
3527e3533.
47. Lewis KN., Liao R., Guinn KM., Hickey MJ., Smith S., Behr MA., et al. (2003), "Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation," J Infect Dis 2003, 187, 117-123.
48. Lin Sang., Guihua Xiong. And Hongxia Zhang. (2012),″ Immunogenicity and protective efficacy against tuberculosis with DNA expressing ESAT6
protein,″ African Journal of Microbiology Research, 6, pp.431-435.
49. M. Harboe., T. Oettinger., H.G. Wiker., I. Rosenkrands. and P. Andesen. (1996),
″Evidence for occurrence of the ESAT6 protein in Mycobacterium
tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG,″ Infec. Immun., 64,16e22.
50. Marri P.R. and et al. (2006), "Comparative genomics of metabolic pathways in Mycobacterium species: gene duplication, gene decay and lateral gene
transfer," FEMS Microbiol Rev, 30, 906-925.
51. Murray P.J., Wang L., Onufryk C., Tepper RI.and Young R.A. (1997), ″T cell- derive IL-10 antagonizes macrophage funtion in mycobacterial infection,″
Journal of Immunology, 158, pp.668s-675s.
diversity of Mycobacterium tuberculosis host immune system protein targets: evidence of limited selective pressure," Genetics, 155, 7-16.
53. Mustafa A.S., Abal A.T. and Chugh T.D. (1999), “Detection of Mycobacterium tuberculosis complex and non-tuberculous Mycobacteria by multiplex polymerase chain reactions”, Eastern Mediterranean Health Journal, 5(1), 61-70.
54. Musser J. M. (1995), “Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria : Molecular genetic insights”, Clinical Microbiology Reviews, 8 (4), 496- 514.
55. N. Ganguly. I. ., Siddipui. and P. Sharma. (2008), ″Role of M.
tuberculosis RD-1 region encoded secretory proteins in protective response
and virulence,″ Tuberculosis (Edinb) 88, 510e517.
56. N. van der Wel., D. Hava., D. Houben., D. Fluitsma., M. van Zon., J. Pierson., et al. (2007), "M. tuberculosis and M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells," Cell, 129, 1287e1298. 57. Palomino J. C. , Sylvia Cardoso Leão, Viviana Ritacco (2007). Tuberculosis
2007: From basic science to patient care, WWW.TuberculosisTextbook.com
58. P. S. Renshaw., P. Panagiotidou., A. Whelan., S.V.Gordon., R.G.
Hewinson., R.A. Williamson., et al. (2002), ″Conclusive evidence that the
major T-cell antigens of the Mycobacterium tuberculosis complex ESAT6
and CFP10 form a tight, 1:1 complex and characterization of the structural properties of ESAT6, CFP10, and the ESAT6/CFP10 complex.
Implications for pathogenesis and virulence,″ J. Biol. Chem.,
277,21598e21603.
59. Pollock JM. and Andersen P. ″Predominant recognition of the ESAT6
protein in the first phase of interferon with Mycobacterium bovis in cattle.,″
Infect Immun1997, 65, 2587-2592.
60. Schlossberg D. (2006), “Tuberculosis and nontuberculous Mycobacteria l infections. Fifth edition”, Medical Publishing Division.
61. Sechi L. A. et al (1997), “Detection of Mycobacterium tuberculosis by PCR analysis of urine and other clinical samples from AIDS and non-HIV- infected patients”, Molecular and Cellular Probes, 11, 281-285.
62. S.T. Cole., R. Brosch., J. Parkhill., T. Garnier., C. Churcher., D. Harris., et al.
(1998), "Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence," Nature 393, 537e544.
63. Todar. and K. (2005), "tuberculosis," http://www.textbookkofbacteriology.net, Accessed 12 April 2008,
64. Van Pinxteren LA., Ravn P., Agger EM., Pollock J. and Andersen P.
(2000), ″Diagnosis of tuberculosis based on the two specific antigens
ESAT6 and CFP10,″ Clin Diagn Lab Immunol 2000, 7, 155-160.
65. Vordermeier HM., Chambers MA., Cockle PJ., Whelan AO. and
Simmons J. (2002), ″Hewinson RG., Correlation of ESAT-6 specific gamma interferon production with pathlogy in cattle following
Mycobacterium bovis BCG vaccination against experimental bovine
tuberculosis,″ Infect Immun, 70, 3026-3032.
66. Waters WR., Nonnecke BJ., Palmer MV., Robbe- Austermann S.,
Bannantine JP.,Stabel JR., et al. (2004), ″Use of recombinant
ESAT6:CFP10 fusion protein for differentiation of infections of cattle by
Mycobacterium bovis and by M. avium subsp.avium and M. avium subsp.
Paratuberculosis,″ Clin Diagn lab Immunol 2004, 11, 729-735.
67. WHO. (2009), ″World health report. Global Tuberculosis control,″ 68. WHO. (2012), ″World health report. Global Tuberculosis control,″
69. World Health Organization (2010). Multidrug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB): 2010 global report on surveillance and response, WHO/HTM/TB/2010.3.
70. World Health Organization (2011), Global Tuberculosis Control, WHO report 2011.
71. Yinlan Bai, Ying Xue, Hui Gao et al (2007), ″Expression and purification of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and MPT64 fusion protein and its
immunoprophylactic potential in mouse model″ , Elsevier, 59, p.189-196.
72. http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Mycobacterial_cell_wall_diagram.pn. 73. http://en.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis
74. http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn 75. http://www.ncbi.nih.gov/BLAST.
76. http://www.benhhoc.com/index.php?do=viewarticle&artid=667 77. http://www.who.int/Fact sheet/ Fact sheet No104/2005