Nguyên lý:
PCR là phản ứng chuỗi trùng hợp dựa vào đặc tính hoạt động của enzym DNA polymerase. Sử dụng cặp mồi đặc hiệu có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Các ADN mới lại được sử dụng làm khuôn.
Gen mã hóa protein CFP10 ở vi khuẩn lao được khuếch đại từ ADN genome
H37Rv với cặp mồi có trình tự nhận biết của enzym giới hạn BamHI:
P2: 5’-GCT GCC GCC ACC GCC GCT TCC GCC ACC GCC GCT TCC ACC GCC ACC GAA GCC CTA TTG CGA GGA CAG CGC CT-3’.
Gen mã hóa protein ESAT6 vi khuẩn lao được khuếch đại với cặp mồi:
P3: 5’-GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGC AGC ATG AAC GAG CAG CAG TGG AAT TTC GCG-3’ và
P4 mang trình tự nhận biết của HindIII: 5’CCA AGC TTT GCG AAC ATC CCA
GTG A-3’.
Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi P1 và P4, hỗn hợp sản phẩm gen mã hóa cho protein CFP10 và ESAT6 được sử dụng làm ADN khuôn. Sản phẩm PCR có kích thước 638bp.
Trong phản ứng PCR luôn tiến hành đồng thời một positive control (chứng dương) với ADN vi khuẩn lao H37Rv và một negative control (chứng âm) là nước.
Thành phần phản ứng bao gồm 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM mồi, 200 mM deoxyribonucleoside triphosphate mixture, 1,5 u Tag polymerase, 1μl ADN mẫu tương đương 50-150 ng ADN, bổ sung nước cất vô trùng vừa đủ 50 μl dung dịch phản ứng.
Điều kiện PCR: Giai đoạn biến tính ban đầu 950C/5 phút; 30 chu kỳ (biến tính 950C/45 giây; lai ghép 610C/45 giây, tổng hợp 720C/45 giây); giai đoạn tổng hợp cuối cùng: 720C/5 phút.
Hiệu quả của quá trình khuếch đại và kích thước sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% nhuộm bằng ethidium bromide.
2.4.2.3. Tách dòng gen mã hóa protein ESAT6-CFP10.
• Vùng gen đặc hiệu quyết định mã hóa protein ESAT6-CFP10 được khuếch đại. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đưa vào plasmid pGEM-T (kit A1360- Promega).
• Sau đó plasmid chứa đoạn ADN cần chèn được biến nạp vào tế bào khả biến DH 5α . Các bước biến nạp:
-Bổ sung 1μl ADN plasmid vào ống tế bào khả biến(50-100μl). -Để ổn định trong đá trong 15 phút.
-Sốc nhiệt ở 420C trong 90 giây, để trong đá 15 phút.
-Bổ sung 400 μl môi trường LB lỏng, nuôi lắc 220v/phút trong 1 giờ, 370C -Cấy trải 100-150μl trên môi trường thạch LB có chứa ampicillin.
-Để trong tủ ấm 370C qua đêm.
Sau đó tách chiết plasmid pGEMT-ESAT6/CFP10 bằng kit tách chiết plasmid (Quick Plasmid Miniprep Kit _Invitrogen).
Các bước tách chiết plasmid.
-Chuyển các tế bào vi khuẩn vào ống li tâm nhỏ. Cho 250μl Buffer P1 -Thêm 250 μl Buffer P2 và đảo trộn 4-6 lần.
-Thêm 350 μl Buffer N3 và đảo trộn 4-6 lần.
-Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Thu dịch nổi. -Ly tâm 13000v/p trong 30-60 giây. Bỏ phần dịch bên dưới
-Thêm 0,5 ml Buffer PB và ly tâm 30-60 giây. Loại bỏ phần dịch bên dưới. -Thêm 0,75 ml Buffer PE và ly tâm 30-60 giây. Loại bỏ phần dịch dưới.
Ly tâm 1 phút để loại bỏ phần đệm rửa còn lại.
- Thêm 50μl Buffer EB ( 10 mM Tris.Cl, pH 8,5) . Để 1 phút rồi ly tâm 1 phút. Sau khi tách chiết, thu được vector pGEMT-ESAT6-CFP10.
• Khẳng định kết quả quá trình tách dòng bằng cách kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với sản phẩm là plasmid vừa tách được, tạo sản phẩm PCR có độ dài mong muốn khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu.
2.4.2.4. Giải trình tự ADN
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định trình tự ADN theo phương pháp enzym học
của Sanger thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotid trên máy giải trình tự tự động
ABI3100 Avant. Nguyên lý:
Nhờ enzym ADN polymerase mà đoạn ADN bổ sung với ADN khuôn được tổng hợp. Đặc trưng của phương pháp này là ngoài 4 loại nucleotid thông thường, còn sử
dụng thêm dideoxynocleotid (ddNTP) là những dideoxynucleotid nhưng nhóm 3’- OH được thay thế bằng –H. Vì vậy các dideoxynucleotid không còn khả năng hình thành các cầu nối phosphodieste nên nó sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp.
Mỗi một loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng một màu khác nhau. Các bước tiến hành theo sơ đồ sau:
Tinh sạch sản phẩm PCR
Chạy PCR gắn BigDye
Tinh sạch BigDye
Biến tính AND trong HiDi Formamid
Chạy máy giải trình tự tự động ABI3100 Avant
Phân tích trình tự gen
Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn lao được tách dòng (sử dụng kit pGEMT), sau đó được giải trình tự để xác định chính xác toàn bộ đoạn gen mã hóa cho protein ESAT6/CFP10 không bị thay đổi. Các khuẩn lạc mang vector pGEMT- ESAT6-CFP10, tách chiết bằng kit tách chiết plasmid và được sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự ADN.
Bước 1: Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit QIAGEN
Các bước được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau: -Cho 5 lần thể tích đệm PB vào 1 lần thể tích của phản ứng PCR và mix. -Đặt cột QIAquick vào tube 2 ml.
-Cho dung dịch mix trên vào cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30-60 giây. Loại bỏ phần dịch qua cột.
-Tiếp tục rửa cột bằng 750 μl đệm PE, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30-60 giây. Loại bỏ phần dịch qua cột. Ly tâm tiếp 13000 vòng/phút trong 30-60 giây.
-Đặt cột QIAquick vào tube 1,5ml vô trùng.
-Thu ADN bằng cách cho 50 μl đệm EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5), ly tâm tiếp 13000 vòng/phút trong 30-60 giây.
Bước 2: Chạy phản ứng PCR gắn BigDye. Trình tự cặp mồi của phản ứng:
Mồi được sử dụng trong phản ứng là trình tự cặp mồi T7; SP6 của bộ sinh phẩm pGEM®-T( kit A1360-Promega).
Thành phần phản ứng:
Hỗn hợp mix cho phản ứng PCR gắn BigDye gồm: 0,2 pmol của ADN mồi; 1 đệm BigDye; BigDye terminator kit và ADN mồi. Bổ sung nước tới thể tích 20μl.
Chu trình nhiệt:
Phản ứng PCR thực hiện trên hệ thống luân nhiệt, với chu trình nhiệt: 1 phút biến tính ở 960C, 30 chu kỳ ( biến tính: 960C/20 giây, lai ghép: 500C/20 giây, tổng hợp: 600C/3 phút), 40/∞.
Bước 3: Tinh sạch sản phẩm PCR gắn BigDye (DyeEx 2.0 Spin kit của QIAGEN).
Các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cụ thể như sau:
-Nới lỏng nắp cột, trộn đều cột nhựa.
-Bỏ phần nhựa bên dưới cột và để cột trong tube 2 ml đã cung cấp sẵn trong bộ kit,ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút.
-Cẩn thận chuyển sang một tube mới. Cho dần phản ứng giải trình tự vào chính giữa cột, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút.
-Thu ADN trong tube sau khi ly tâm, làm khô ADN bằng máy hút chân không.
Bước 4: Biến tính ADN trong HiDi Formanid và chạy Sequencing.
-Sản phẩm tinh sạch sau khi đã làm khô, được thêm vào mỗi tube 20μl HiDi. Sau đó biến tính ở 950C/5 phút, chuyển vào đá ngay lập tức trong 5 phút.
-Cuối cùng đưa toàn bộ thể tích dung dịch ADN đã được biến tính vào máy giải trình tự tự động ABI avant 3100. Vận hành máy đúng quy trình phần mềm đã cài đặt.
Bước 5: Phân tích kết quả
Kiểm tra kết quả thu được bằng phần mềm của máy ABI avant 3100 DNA analyzer. Trình tự của đoạn gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 được so sánh với chủng chuẩn H37Rv ( GenBank accession number BX842575). Vận hành máy theo đúng quy trình phần mềm đã cài đặt, kiểm tra kết quả thu được bằng phần mềm của máy ABI System 3100, phân tích kết quả bằng phần mềm BioEdit, MEGA và khai thác dữ liệu sử dụng công cụ blast so sánh trình tự trên GenBank [75].
2.4.2.5. Thiết kế vector tách dòng pGEMT chứa đoạn gen mã hóa protein CFP10/ESAT6
Chủng vi khuẩn lao sử dụng cho nghiên cứu: H37Rv do khoa Vi sinh, bệnh viện
Phổi Trung ương cung cấp. Các bước tiến hành:
• ADN genome của chủng H37Rv được tách chiết bằng bộ sinh phẩm QIAamp DNA của hãng QIAGEN, Mỹ. Các bước tiến hành tương tự như ở mục 2.4.1.
• Phản ứng PCR1 khuếch đại gen mã hóa cho protein CFP10 được thực hiện với cặp mồi P1; P2.
• Phản ứng PCR2 khuếch đại gen mã hóa cho protein ESAT6 được thực hiện với cặp mồi P3; P4.
Tiếp tục tiến hành phản ứng PCR3 sử dụng sản phẩm của PCR1 và PCR2 làm ADN khuôn theo tỷ lệ 1:1; sử dụng cặp mồi P1 và P4. Sản phẩm của PCR3 có kích thước 645bp.
• Thành phần phản ứng bao gồm 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM mồi, 200 mM deoxyribonucleoside triphosphate mixture; 1,5 u Tag polymerase, 1 μl ADN mẫu tương đương 50-150 ng ADN, bổ sung nước cất vô trùng vừa đủ 50 μl dung dịch phản ứng.
• Điều kiện PCR: Giai đoạn biến tính ban đầu 950C/5 phút; 30 chu kỳ (biến tính: 950C/45 giây; lai ghép: 610C/45 giây, tổng hợp: 720C/45 giây); giai đoạn tổng hợp cuối cùng: 720C/5 phút.
• Hiệu quả của quá trình khuếch đại và kích thước sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% nhuộm bằng ethidium bromide.
• Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đưa vào plasmid pGEM®-T (kit A1360- Promega) theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.
• Sau đó plasmid chứa đoạn ADN cần chèn được biến nạp vào tế bào khả biến DH5α, tế bào vi khuẩn này được mọc, phân lập trên môi trường LB agar có bổ sung Xgal, IPTG, ampicillin. Các bước biến nạp tương tự như ở mục 2.4.3
Khuẩn lạc trắng được nuôi cấy trên môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin và được tách chiết bằng kit tách chiết plasmid (Quick Plasmid Miniprep Kit- Invitrogen), thu được vector pGEMT-CFP10-ESAT6.
• Khẳng định kết quả quá trình tách dòng bằng cách kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với sản phẩm là plasmid vừa tách được, tạo sản phẩm PCR có độ dài mong muốn, khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu.
• Kiểm tra trình tự bằng máy giải trình tự theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lựa chọn chủng tách dòng có trình tự đoạn gen mã hóa protein CFP10/ESAT6 có độ tương đồng 100% so với chủng chuẩn.
2.4.2.6. Thiết kế vector biểu hiện pET21a chứa đoạn gen mã hóa protein CFP10/ESAT6
Nguyên lý:
T4 ligase xúc tác tạo liên kết photphatdieste bằng cách liên kết đầu 5’ photphat trong phân tử ADN này với đầu 3’ hydroxyl của phân tử ADN kia do vậy có thể nối 2 sợi ADN khác nhau. Vector biểu hiện tái tổ hợp được thiết kế bằng cách ghép đoạn gen ESAT6-CFP10 vào plasmid pET21a sau khi đã xử lý bằng 2 enzym giới
hạn BamHI và HindIII.
Các bước tiến hành:
• Tăng sinh chủng tách dòng DH5α-pGEMT-CFP10-ESAT6 trong môi trường LB agar có bổ sung Xgal, IPTG, ampicillin qua đêm, sau đó được tách chiết bằng kit tách chiết plasmid (Quick Plasmid Miniprep Kit-Invitrogen)( tương tự như ở mục
2.4.2.3) thu được vector pGEMT-CFP10-ESAT6 mang vị trí nhận biết của enzym
giới hạn BamHI và HindIII.
• Vector biểu hiện pET21a (Novagen), được mở vòng bằng cách cắt đồng thời với 2
enzym BamHI và HindIII.
Phản ứng thủy phân bao gồm: 10 μl pET21a; 2 μl HindIII (20 units/ μl); 2 μl BamHI (20 units/ μl); 5 μl đệm phản ứng; 0,5 μl BSA; thêm nước vừa đủ 50 μl. Ủ 370C/3 giờ. Chạy gel 1% agarose, thu sản phẩm là vector pET21a mở vòng được tinh sạch bằng Gel Extraction kit (Cat. No 28704-QIAGEN).
Các bước tinh sạch:
-Cắt vùng gel chứa đoạn ADN quan tâm trên bản điện di.
-Cân đoạn gel vừa cắt được và xác định thể tích đoạn gel này theo quy ước 1mg trọng lượng sẽ tương đương với 1μl thể tích.
-Bổ sung dịch kết gắn ADN vào cột tinh sạch GB (Gel Binding) theo tỷ lệ Vmẫu: VGB= 1: 3.
-Ủ hỗn hợp ở 500C trong 10 phút và cứ 2-3 phút đảo nhẹ 1 lần cho đến khi gel tan hoàn toàn.
-Thêm isopropanol vào mẫu theo tỷ lệ V mẫu: V isopropanol =1:1 và lắc đều.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết ADN và li tâm 13000 vòng/phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
-Loại bỏ phần dịch chảy qua cột.
-Thêm 0,5 ml dung dịch đệm QG vào cột và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút.
- -Thêm 0,75ml đệm PE, li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột và li tâm thêm 1 lần nữa trong vòng 1 phút để loại bỏ đệm.
-Chuyển cột sang 1 ống Eppendorf mới 1,5 ml. Bổ sung 50ml đệm EB, li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu ADN.
• Vector pGEMT-CFP10-ESAT6 được thực hiện phản ứng thủy phân với enzym
BamHI và HindIII, 10 μl pET21a; 2 μl HindIII (20 units/ μl); 2 μl BamHI (20units/
μl); 5 μl đệm phản ứng; 0,5 μl BSA; thêm nước vừa đủ 50 μl. Ủ 370C/3 giờ. Chạy gel 1% agarose, thu sản phẩm là đoạn gen mã hóa CFP10-ESAT6 mang đầu so le
của HindIII và BamHI được tinh sạch bằng Gel extraction kit (Cat.No.28704-
QIAGEN).
• Phản ứng nối (ligation) theo tỷ lệ 3:1 (về số mol) giữa đoạn gen mã hóa CFP10-
ESAT6 mang đầu so le của của BamHI và HindIII và vector pET21a đã được mở vòng cùng bằng enzym BamHI và HindIII, sử dụng enzym T4 DNA ligase
(M0202L-New England Biolabs).
• Sản phẩm pET21a-CFP10-ESAT6 được biến nạp vào tế bào khả biến DH5α, tế bào vi khuẩn này được mọc, phân lập trên môi trường LB agar có bổ sung Xgal, IPTG, ampicillin. Dòng tế bào DH5α-pET21a-CFP10-ESAT6 được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin và được tách chiết bằng kit tách chiết plasmid (Quick Plasmid Miniprep Kit-Invitrogen), ( tương tự như ở 2.4.3), thu được vector pET21a-CFP10-ESAT6.
_ Làm khô sản phẩm (vector pET21a-CFP10-ESAT6) bằng máy hút chân không. Thêm 50ml nước khử ion, để ở nhiệt độ phòng cho tan hoàn toàn. Plasmid có thể được bảo quản ở -200C để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
• Vector pET21a-CFP10-ESAT6 được biến nạp vào chủng biểu hiện BL21(DE23), tế bào vi khuẩn này được mọc, phân lập trên môi trường LB Agar có bổ sung Xgal,IPTG, ampicillin. Thu được dòng tế bào BL21-pET21a-CFP10-ESAT6.
2.4.2.7. Biểu hiện protein ESAT6-CFP10 trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3)
Nguyên lý:
E.coli BL21(DE3) là chủng biểu hiện mang gen mã hóa enzym T7 RNA polymerase trong genome. Khi trong môi trường có IPTG, enzym này sẽ được kích hoạt bám vào promotor của vector tái tổ hợp khởi động quá trình dịch mã sản xuất protein SEB. Sau đó, dựa vào tác động vật lý của sóng siêu âm, tế bào vỡ ra và giải phóng protein nếu protein ở dạng hòa tan trong tế bào chất.
Tiến hành:
-Nuôi lỏng khuẩn lạc trong 10ml môi trường LB lỏng có kháng sinh ampicilin ở nhiệt độ 370C, lắc 220 vòng/phút qua đêm.
-Hoạt hóa tế bào: Lấy 0.5 ml dịch khuẩn nuôi qua đêm chuyển sang 10ml môi trường LB lỏng có kháng sinh như trên, nuôi ở 370C, lắc 220 vòng/phút trong 1-2 giờ, đến khi OD600 đạt 0,4-0,6.
-Cảm ứng bằng IPTG: Bổ sung IPTG ở các nồng độ 1mM vào dịch khuẩn thu được ở bước 2, nuôi lắc 220 vòng/phút trong khoảng thời gian 3 giờ ở 370C.
-Thu khuẩn lạc vào ống Falcon 50 ml, rửa cặn khuẩn bằng dung dịch đệm PBS 1X 3 lần. Bổ sung PBS1X, hòa tan tế bào vi khuẩn, ủ trong đá và tiến hành siêu âm tế bào. Sau đó ly tâm 13000v/p trong 15 phút.
-Cặn khuẩn được rửa lại bằng dung dịch PBS1X.
-Protein thu được từ phần dịch nổi được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE) sử dụng gel tách 12% và gel cô 4%.
Công thức pha gel tách 12%
Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel 12% 10ml dH2O vô trùng 3,3 30% Acrylamide 12% 4,0 Tri-HCl 1,5M; pH 8,8 0,375M 2,5 10%SDS 0,1% 0,1 105APS 0,1% 0,1 TEMED 0,002% 0,004
Công thức pha gel cô 4%
Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel 4% 3ml dH2O vô trùng 2,1 30% Acrylamide 4% 0,5 Tri-HCl 1M; pH 6,8 0,13M 0,38 10%SDS 0,1% 0,03 105APS 0,1% 0,03 TEMED 0,001% 0,003
2.4.2.8. Tinh sạch protein ESAT6/CFP10
Nguyên lý:
Protein tái tổ hợp thu được dưới dạng dung hợp có đuôi His_tag nên dễ dàng tinh sạch