6. Trình bày dữ liệu
KẾT NỐI GC-MS ; LC-MS
2. Kết nối LC-MS
Vài nét về sắc ký lỏng ghép khối phổ:
LC-MS là phương pháp được dùng trong phân tích vết (ppb, ppm) các hợp chất cần nhận danh chính xác. Trong những điều kiện vận hành nhất định ngoài thời gian lưu đặc trưng, các chất còn được nhận danh bằng khối phổ của nó.Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ phải đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Nguyên nhân là do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất
phân tích ở thể lỏng.
Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao diện. Phương pháp HPLC dược dung để tách các chất lỏng khó bay hơi, không thể tách được bằng GC. Sự kết hợp giữa LC và MS cũng cho những thuận lợi tương tự GC/MS. Tuy nhiên interface ở đây đóng vai trò quan trọng và gồm nhiều loại khác nhau:
+ Bộ kết nối nạp chất lỏng trực tiếp ( direct liquid insertion – DLI) + Bộ kết nối bang chuyền ( moving belt interface)
+ Bộ nối phun nhiệt (thermospray)
+ Bộ kết nối bắn phá nguyên tử nhanh dòng lien tục (CF-FBA, continuous flow fast atom bombardment)
+ Bộ kết nối phun điện
3. Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm tia hạt (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FAB),… đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập nhiên 80, mới có sự đột phá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API)
Để ghép nối được giữa LC và MS cần: Giao diện ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI ( atmospheric pressure chemical ionisation) ; Giao diện phun điện ESI (electrospray)
Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích.
Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS: • Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI).
• Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization – APCI).
• Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photoionization – APPI).
Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả.
3.2. Ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI
• Nito được dùng để phun sương pha động tạo thành một sol khí hay khí rung (aerosol) của khí nito và các giọt nhỏ dung môi
• Sol khí này được đưa qua một khu vực được đốt nóng. Ở đây dung môi bị loại và các chất được ion hoá nhờ các phản ứng ion – phân tử ở áp suất khí quyển, các electron và các ion sơ cấp được tạo ra do phóng điện
Khái quát: APCI là kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng để phân tích những hợp chất có
độ phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi. Trong APCI, ion đươc hình thành như sau: mẫu hợp chất cần phân tích, hòa tan trong pha động, sau khi ra khỏi cột sắc ký, được cho đi ngang qua ống mao quản đốt nóng. Khi ra khỏi ống, nhờ khí N2, dung dịch được phun thành dạng sương từ đầu ra của nguồn APCI. Các giọt sương nhỏ được một dòng khí dẫn đến một ống thạch anh đun nóng, gọi là buồng dung môi hóa khí. Hợp chất đi theo luồng khí nóng ra khỏi ống để đến một vùng có áp suất khí quyển, nơi đây sẽ xảy ra sự ion hóa hóa học nhờ vào que phóng điện corona, tại đây có sự trao đổi proton để biến thành ion dương (MH)+ và trao đổi electron hoặc proton để biến thành ion âm (MH)-. Sau đó, các ion sẽ được đưa vào bộ phân tích khối.
Giải thích: Sự hình thành ion chủ yếu trong APCI e- + N2 → N2+. + 2e- Sự hình thành ion thứ yếu: N2+. + H2O → N2 + H2O+. H2O+. + H2O → H3O+ + HO. Sự chuyển proton: H3O+ + M → MH+ + H2O
Kỹ thuật: Các ion được sinh ra và được phân tích như sau:
+ Vòi phun APCI phun dung dịch mẫu thành những giọt sương. Những giọt sương này được hóa hơi trong ống thép ở nhiệt độ cao
+ Thế được đặt vào kim ở gần lối ra của ống thép. Thế cao tạo ra sự phóng điện vòng tròn, hình thành những ion phản ứng qua chuỗi những phản ứng hóa học với những phân tử dung môi và khí nito bao quanh
+ Những ion phản ứng lại phân tử mẫu để hình thành những ion mẫu + Những ion mẫu vào phổ khối và được phân tích
Thường dùng trong LC/MS
Ưu điểm: Khi những ion dung môi hiện diện ở áp suất thường thì sự ion hóa hóa học của
các ion phân tử phân tích có hiệu quả cao
+ Ở áp suất thường, các ion phân tử mẫu thường xuyên va chạm với ion của thuốc thử + Quá trình chuyển dịch proton hay phản ứng proton hóa dễ xảy ra
+ Qúa trình cộng kết điện tử hay khử proton tạo MH+ (MH-) dễ hình thành
+ Những ion đa hóa trị không tồn tại do quá trình ion hóa có mức năng lượng cao hơn ESI
So sánh ESI và ACPI
ESI APCI
+ Ion hóa ở pha lỏng trong vùng thế cao. Các chất phân cực hơn sẽ dễ dạng ion hóa hơn
+ Bay hơi dung môi > tạo hạt sương nhỏ hơn
+ Ion tạo thành sẽ di chuyển nhờ lực hút tĩnh điện ( Các ion có mật độ điện tích cao và sức căng bề mặt thấp se di chuyển dễ hơn)
+ Bay hơi dung môi, chất phân tích. Dễ dàng phân tích các chất có phân tử lượng nhỏ và ít phân cực
+ Ion hóa các chất, tạo ion ở thể khí bởi kim tích điện thế cao
+ Ion tạo thành bởi phản ứng giữa ion proton và phân tử chất phân tích
3.1. Giao diện phun điện ESI
Các giọt dung dịch thu nhỏ và tăng điện tích Các phân tử dung môi không tích điện bị loại
+ Ion hoá bằng phun điện ESI ( Electrospray ionization)
ESI có khả năng tạo thành những ion đa điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), được xem là kỹ thuật ion hóa êm dịu, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein, peptide, nucleotide… hoặc các polyme công nghiệp như polyethylen glycol.
Tạo ra ion từ phân tử trong dung dịch, dung dich ở trong một mao quản kim loại. Người ta đặt một điện trường giữa 2 đầu mao quản và một điện cực biến phân tử được ion hóa thành những giọt nhỏ, những giọt nhỏ này sau đó tạo thành những giọt nhỏ hơn, tạo ra các phân tử với các proton đính kèm. Các ion phân tử proton sau đó sẽ được đưa qua máy phân tích khối
Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI
Giaỉ thích:
+ Dung dịch mẫu đi vào vòi phun ESI, nơi đặt điện thế cao
+ Vòi phun ESI phun dung dịch mẫu dưới dạng sương tạo ra những giọt sương mù tích điện trên bề mặt
+ Mật độ tích điện trên bề mặt của những hạt sương gia tang làm cho tương tác tĩnh điện tăng dẫn tới các hạt bị vỡ ra, chia thành những giọt sương mới nhỏ hơn. Tiến trình cứ lặp đi lặp lại
+ Từ những giọt sương rất nhỏ tích điện cao tạo ra những ion mẫu chuyển vào thể khí bằng lực đẩy tĩnh điện
+ Những ion này đi vào bộ phận phận tích khối và được phân tích
Ưu điểm: ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn như các hợp chất sinh học (protein, nucleotide, peptid, …) hoặc các polymer công nghiệp như polyetyl glycol…
+ Rất thích hợp cho phân tích theo kỹ thuật MS/MS, kết hợp với bẫy ion tứ cực, bộ ba + Có thể phân tích những ion tích điện >1 có khối lượng lớn
+ Không bị ảnh hưởng bởi nền mẫu
Nhược điểm: Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải được biến thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phun sương. Điều này phụ thuộc vào: dung môi sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch. Các dung môi phù hợp để phun sương là: methanol,
acetonitrile,ethanol,…
+ Sự hiện diện của các muối, cặp ion của thuộc thử (TFA) có thể làm giảm độ nhạy của phương pháp
+ Sự tạo phức làm giảm độ nhạy
+ Không thể phân tích nhiều thành phần
+ Những ion đa hóa trị rất dễ nhầm lẫn nhất là phân tích hỗn hợp + Cần độ tinh khiết cao
NanoESI:
Đầu mũi kim được thiết kế rất nhọn và đặt ở vị trí rất gần với đường dẫn tới thiết bị phân tích khối phổ
Ưu điểm hơn ESI: + Làm tăng hiệu quả quá trình phân tích, tăng độ nhạy, tỷ lệ dòng thấp (giảm lượng mẫu đo), kích thước hạt nhỏ
+ ÁP dụng tốt cho LC/MS
+ Có thể áp dụng cho dung dịch muối ở nồng độ thấp (micro) + Áp dụng được cho những ion đa hóa trị
+ Ion hóa mềm
Nhược điểm: + Tỷ lệ dòng thấp đòi hỏi tính năng cao của thiết bị + Có thể bị hạn chế khi phân tích hỗn hợp
Kết nối HPLC(LC)/MS
Được bắt nguồn từ hệ thống sắc ký lỏng, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang tích điện tại bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương, khi đó, mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng. Mật độ điện tích này tăng đến một điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh) để từ đó hạt sương phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối.