3.3.1. Sơ đồ tổng quan nghiên cứu
Mẫu cá Lấy mẫu KST Soi tươi Phân loại Kết luận Làm tiêu bản
Hình 3.3. Phương pháp nghiên cứu toàn diện ký sinh trùng trên cá của Viện sỹ V.A Dogiel, được bổ sung của Hà Ký và Bùi Quang Tề, 2007.
3.3.2. Thứ tự nghiên cứu
- Trước tiên đặt cá lên khay, tiến hành quan sát cá bằng mắt thường để phát hiện những ký sinh trùng có kích thước lớn. Sau đó tiến hành cạo nhớt da cho lên lam kính rồi nhỏ thêm vài giọt nước cất, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi.
- Kiểm tra mang: Cắt bỏ xương nắp mang, quan sát trạng thái mang của cá. Cắt rời từng cung mang, cạo nhớt mang cho lên lam kính, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi.
- Kiểm tra ruột: Tiến hành giải phẩu cá, tiến hàng mổ dọc ruột cá, cạo dịch ruột đưa lên lam kính, nhỏ một vài giọt nước và quan sát dưới kính hiển vi
- Chuẩn bị các tiêu bản cố định:
Những kính đã phết mẫu và cố định bằng Shaudin hoặc phơi khô trong không khí, nhuộm màu Hematoxylin. Hoặc các kính để khô trong không khí có thể nhuộm AgNO3 2%.
+ Dùng bạc nitơrat 2%: Các lamen có mẫu đã giữ khô, xếp vào đĩa peptri mặt có trùng ngữa lên trên. Dùng pipet nhỏ dung dịch AgNO3 2% lên chỗ phết mẫu, đậy nắp đĩa peptri để tất cả vào buồng tối trong thời gian từ 10-15 phút, lấy ra rửa qua nước cất 3-4 lần, tất cả các kính sau khi rữa chuyển sang đĩa nước cất khác để mặt có trùng hướng lên trên, đem phơi dưới ánh sáng mạnh của mặt trời trong thời gian từ 1-1,5 giờ, sau đó phơi tiếp trong ánh sáng đèn thạch anh thuỷ ngân trong vòng 20-30 phút. Trong quá trình phơi cần kiểm tra các mẫu phết kính trong 1/2 thời gian quy định, nếu quan sát thấy rõ các cơ quan của trùng thì ngừng phơi. Rữa lại mẫu trong nước cất, để khô tự nhiên trong không khí, gắn tiêu bản bằng nhựa Canada và ghi etyket.
+ Nhuộm mẫu bằng Hematoxylin: Lấy những mẫu đã cố định trong cồn 700 ra rửa qua nước cất từ 2-3 phút, sau đó cho mẫu vào dung dịch fericsulfat amonium 3% từ 12-24 giờ cho mẫu gắn chặt vào kính. Tiếp tục rửa qua nước cất 3-5 phút rồi cho vào thuốc nhuộm hematoxylin trong khoảng 12 giờ để nhuộm màu, sau đó rửa qua vòi nước chảy. Kính phết nhuộm màu tốt sẽ có màu xanh lơ thẫm hoặc màu gần như đen, cho phết kính nhuộm màu vào phân biệt trong
dung dịch fericsulfat amonium 1,5%. Kiểm tra dưới kính hiển vi cho đến khi thấy rõ các cơ quan của trùng, rửa trong nước cất 1 - 2 lần. Lần lượt cho qua các nống độ cồn 500, 700, 900 , 960, 1000, xylen trong thời gian từ 3 - 5 phút. Gắn tiêu bản bằng nhựa Canada.
3.3.3. Phân loại ký sinh trùng
- Sử dụng một số tài liệu để phân loại KST: Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam của Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007).
- Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng đơn bào của Lom và Dykova, (1992), Monogenea, Trematoda, Crustacea ký sinh ở cá của Yamaguti (1958, 1960, 1963, 1971).