Metarhizium anisopliae trong môi trƣờng gạo với các phƣơng pháp sản xuất khác nhau
Mục đích: tìm ra môi trường nuôi cấy chế phẩm nấm Ma phù hợp để cho ra số lượng bào tử nhiều nhất trong thời gian ngắn nhất.
Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy có chứa bào tử nấm Ma
Sử dụng chủng nấm Ma do Bộ môn Bảo vệ Thực Vật cung cấp, cấy nguồn nấm vào đĩa petri môi trường SDAY3 (Sabouraud Dextrose Agar Yeast) được nghiên cứu là tốt nhất cho sự phát triển của nấm Ma. Sau đó trữ nấm ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 10-14 ngày để chuẩn bị làm thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại môi trường (bảng 2.1), mỗi nghiệm thức gồm 10 bọc nylon chứa 500g gạo. Các bọc nylon có chứa môi trường thử nghiệm được thanh trùng ướt ở 121o
C trong 45 phút trước khi chủng nấm Ma. Mỗi bọc nylon chủng 10 khoanh (đường kính 9 mm) môi trường có chứa bào tử nấm Ma (tương đương nồng độ 108 bào tử/ml), sau đó đem ủ chế phẩm ở điều kiện nhiệt độ phòng bình thường.
18
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng cơ chất của từng nghiệm thức
Nghiệm thức
Thành phần môi
trƣờng Phƣơng pháp sản xuất
A Cơm, nước, dầu ăn Gạo rửa qua với nước sạch, sau đó cho 300 ml nước + 20 ml dầu ăn) nấu thành cơm. Sau đó chia cơm vào từng bọc nylon (500g/bọc), bịt kín bằng nút bông gòn không thấm.
B Gạo, Nước, dầu ăn Gạo được chia vào bọc nylon (400g/bọc), cho vào 150 ml nước + 10 ml dầu ăn, bịt kín bằng nút bông gòn không thấm.
C Gạo, Nước Gạo ngâm nước trong 60 phút, sau đó cho vào từng bọc nylon (500g/bọc), bịt kín bằng nút bông gòn không thấm.
D Gạo, Nước + CaCO3 Gạo ngâm nước + 5% CaCO3 trong 60 phút, sau đó cho vào từng bọc nylon (500g/bọc), bịt kín bằng nút bông gòn không thấm.
Chỉ tiêu đánh giá
- Tỷ lệ tạp nhiễm của từng loại môi trường
Ở từng loại môi trường, tỷ lệ tạp nhiễm sẽ được ghi nhận và đánh giá vào thời điểm 10 ngày sau khi cấy.
- Mật số bào tử trong thời gian thí nghiệm.
Lấy năm bọc chế phẩm cố định ở từng môi trường để đánh giá mật số bào tử. Số lượng bào tử quan sát và đếm được vào các thời điểm 5, 10, 15 và 20 ngày sau khi cấy, mỗi bọc lấy 5 g môi trường có chứa bào tử nấm trong mỗi bọc nilon + 9ml dung dịch nước cất bổ sung thêm chất bám dính Thần Hổ cho vào ống nghiệm, xác định sự hiện diện của bào tử cho từng nghiệm thức môi trường bằng lame đếm hồng cầu hiệu Thoma.
19 Công thức tính mật số bào tử/g chế phẩm:
Số bào tử/g = 4 x 106 x a x b
Trong đó: a: số bào tử trung bình/ô nhỏ nhất b: hệ số pha loãng (HSPL)
(Theo Kunimi và Nakai, 2001)
2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự hình thành và phát triển bào tử của nấm
Metarhizium anisopliae trong môi trƣờng gạo đƣợc chủng bằng kim tiêm trong điều kiện phòng thí nghiệm
Mục đích: Chọn môi trường phù hợp nhất từ thí nghiệm 1 và thử nghiệm phương pháp chủng nấm bằng kim tiêm nhằm đơn giản hóa quy trình sản xuất nấm quy mô bán công nghiệp.
Chuẩn bị nguồn nấm
Sử dụng nguồn nấm Ma tương tự thí nghiệm 1, sau 14 ngày thu lấy mật số bào tử và hiệu chỉnh ở nồng độ 108 bào tử/ml.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện với thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, với 40 bọc môi trường gạo. Mỗi bọc được cho vào 400g gạo cùng với 150ml nước + 10ml dung dịch dầu ăn (giống với nghiệm thức B ở thí nghiệm 1), sau đó đem thanh trùng ướt ở 121oC trong 45 phút trước khi được chủng nấm Ma. Mỗi bọc nylon chủng vào 10 ml dung dịch huyền phù Ma nồng độ 108 bào tử/ml bằng kim tiêm (chủng nấm bên ngoài tủ cấy). Mỗi lần cấy nấm rút 10 ml dung dịch huyền phù nấm tiêm thẳng vào bọc có chứa môi trường, sau đó đem ủ chế phẩm ở điều kiện nhiệt độ phòng bình thường.
Chỉ tiêu đánh giá
- Đánh giá mật số bào tử trong thời gian thí nghiệm: phương pháp đánh giá giống với thí nghiệm 1.
20 - So sánh tốc độ sinh bào tử của phương pháp chủng nấm bằng kim tiêm và phương pháp chủng nấm truyền thống được thực hiện ở nghiệm thức B (Gạo/Nước/Dầu) của thí nghiệm 1 ở thời điểm 5, 10, 15 và 20 NSKC.
2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu lực của chủng nấm xanh Ma từ phòng NEDO và 5 chủng Ma - H1, H2, H3, H4, H5 từ Hungary trong điều kiện phòng thí nghiệm
Chuẩn bị sùng khoai lang (SKL)
Thành trùng sùng khoai lang được thu bằng mồi pheromone do phòng thí nghiệm sinh học bộ môn BVTV cung cấp và mẫu khoai lang bị nhiễm sùng trên những ruộng sau thu hoạch ở huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long đem về phòng thí nghiệm NEDO. Tại phòng thí nghiệm, ở điều kiện nhiệt độ phòng, sùng được cho vào một hộp nhựa được đậy bằng vải mùng tạo sự thông thoáng cùng một củ khoai lang chưa bị nhiễm sùng. Khi tiến hành bố trí thí nghiệm, thành trùng sùng khỏe mạnh và đồng đều được lựa chọn để làm thí nghiệm.
Chuẩn bị huyền phù dung dịch nấm
Nấm xanh Ma của Việt Nam và các chủng nấm xanh từ Hungary được nuôi cấy trên môi trường SDAY3 và pha loãng ở nồng độ 108 bào tử/ml có chứa chất bám dính Thần Hổ 1 ‰.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 7 nghiệm thức (7NT) và 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại dùng 30 thành trùng SKL, mỗi thành trùng được nuôi riêng trong một hộp nhựa nhỏ có lót giấy thấm giữ ẩm và bổ sung thức ăn là một mẫu khoai lang. Sùng khoai lang ở mỗi nghiệm thức lần lượt được nhúng vào dung dịch huyền phù nấm trong vòng 30 giây, sau đó được lấy ra cho vào mỗi hộp nhỏ nhằm tránh lây bệnh lẫn nhau.
21
Chỉ tiêu đánh giá
Theo dõi ghi nhận số thành trùng SKL chết và sống mỗi ngày và tỷ lệ chết trung bình (%) được tính ở 2, 4, 6, 8 và 10 ngày sau khi xử lý (NSXL) và tính độ hữu hiệu theo công thức Abbott (1925). Công thức tính tỷ lệ mọc nấm trở lại: Tỉ lệ (%)=(a/b)*100% Trong đó: a: số sùng có mọc nấm b: tổng số sùng thí nghiệm Công thức Abbott: ĐHH (%) = [(C – T) / C] * 100 Trong đó: C: Tỷ lệ % sùng sống ở nghiệm thức đối chứng. T: Tỷ lệ % sùng sống ở nghiệm thức có xử lý nấm. ĐHH: Độ hữu hiệu (%). Phƣơng pháp xử lý số liệu
Tất cả các số liệu được xử lý bằng chương trình Microsoft Excel 2007 và thống kê bằng chương trình SPSS và MSTATC.
22
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát sự hình thành và phát triển bào tử của nấm Metarhizium anisopliae trong môi trƣờng gạo với các phƣơng pháp sản xuất khác nhau anisopliae trong môi trƣờng gạo với các phƣơng pháp sản xuất khác nhau
Bảng 3.1. Mật số bào tử nấm M. anisopliae trên nền cơ chất gạo được xử lý khác nhau
Nghiệm thức Mật số bào tử (x10
9
bào tử/ml)
5NSKC 10NSKC 15NSKC 20NSKC 25NSKC
A 0,48a 1,37a 1,60a 1,73a 1,69a
B 0,27 b 0,90 b 1,37ab 1,42a 1,14a
C 0,12 c 0,73 b 1,00 b 0,76 b 0,63 b
D 0,17 c 0,90 b 1,27ab 1,30a 1,06a
CV (%) 31,17 23,83 22,96 25,60 29,37
Mức ý nghĩa ** ** * ** **
Số liệu thống kê đã được chuyển đổi sang log10
Ghi chú: trong cùng một cột, các trung bình có cùng mẫu tự theo sau giống nhau thì không khác biệt ý nghĩa qua phép thử Duncan.
*: khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. **: khác biệt ở mức ý nghĩa 1%
Kết quả bảng 3.1 cho thấy mật số bào tử của các nghiệm thức có tốc độ tăng trưởng khác nhau qua từng thời điểm. Mật số bào tử nhiều nhất là tại thời điểm 20 NSKC và bắt đầu giảm tại thời điểm 25 NSKC. Đó có thể là do các bào tử nấm đã bước sang giai đoạn chết (death phage) theo nguyên lý về đường cong sinh trưởng trong nuôi cấy vi sinh vật trong hệ kính (Joanne Willey et al, 2007).
Xét tại thời điểm 5 NSKC, mật số bào tử của tất cả các nghiệm thức đã có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% ở các nghiệm thức. Cụ thể, mật số bào tử cao nhất là ở nghiệm thức A đạt 0,48 x 109 bào tử/ml, nhiều hơn lần lượt là 4 lần và 2,82 lần so với mức thấp nhất là hai nghiệm thức C (0,12 x 109 bào tử/ml) và D (0,17 x 109 bào tử/ml).
23 Thời điểm 10 NSKC cho thấy ở mức ý nghĩa 5%, mật số bào tử của nghiệm thức A là cao nhất (1,37 x 109 bào tử/ml), ba nghiệm thức B (0,90 x 109 bào tử/ml), C (0,73 x 109 bào tử/ml) và D (0,90 x 109 bào tử/ml) không có khác biệt thống kê. So với các nghiệm thức B, C, D; nghiệm thức A có mật số bào tử nhiều hơn lần lượt là 1,52 lần, 1,88 lần và 1,52 lần.
Thời điểm 15 NSKC, không có khác biệt thống kê giữa nghiệm thức A (1,60 x 109 bào tử/ml) với nghiệm thức B (1,37 x 109 bào tử/ml) và D (1,27 x 109 bào tử/ml). Tuy nhiên, giữa nghiệm thức A và C (1,00 x 109 bào tử/ml) lại có khác biệt, cụ thể là 1,6 lần.
Thời điểm 20 NSKC, 3 nghiệm thức A (1,73 x 109 bào tử/ml), B (1,42x109bào tử/ml), D (1,30 x 109 bào tử/ml) không có khác biệt thống kê, tuy nhiên lại có khác biệt thống kê với nghiệm thức C (0,76 x 109 bào tử/ml). Điều này có thể là do cơ chất của nghiệm thức C chỉ được đơn thuần xử lý qua với nước.
Thời điểm 25 NSKC cho thấy mật số bào tử các nghiệm thức đang bắt đầu suy giảm. Tuy nhiên, ở nghiệm thức A thì mật số bào tử vẫn ở mức nhiều nhất (1,69 x 109 bào tử/ml) tương đương nghiệm thức B và không có biệt ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức cho kết quả thấp nhất là nghiệm thức C (0,63 x109bào tử/ml) do cơ chất của nghiệm thức C chỉ được đơn thuần xử lý với nước. Tóm lại, bảng 3.1 cho thấy hai nghiệm thức A và B được xử lý dầu ăn luôn cho số lượng bào tử nhanh và cao hơn hai nghiệm thức còn lại. Trong khi đó, nghiệm thức xử lý ngâm nước luôn luôn thuộc nhóm sinh bào tử kém nhất trong mọi thời điểm. Nguyên nhân bào tử ở hai nghiệm thức A và B luôn trong tốp cao nhất có lẽ do được xử lý với dầu ăn, dung dịch chứa nhiều vi chất và chất khoáng, tạo điều kiện thuận lợi hơn cho nấm phát triển.
24
3.2. Khảo sát sự hình thành và phát triển bào tử của nấm xanh M. anisopliae
trong môi trƣờng gạo đƣợc chủng bằng kim tiêm trong điều kiện phòng thí nghiệm
Bảng 3.2 cho thấy ở mức ý nghĩa 5% có sự khác biệt thống kê giữa các ngày sau khi cấy. Cụ thể, mật số bào tử tăng dần từ thời điểm 5 NSKC đến thời điểm 21 NSKC, dấu hiệu tăng liên tục cho thấy nấm trong môi trường nuôi cấy vẫn chưa chuyển sang giai đoạn ổn định (stationary phase) hoặc chết (death phase) mà vẫn đang trong giai đoạn tăng sinh (log phase).
Bảng 3.2. Mật số bào tử phát triển trên nền cơ chất gạo với dung dịch dầu ăn khi được chủng bằng kim tiêm
Ngày sau khi
chủng Mật số bào tử (x 10 9 bào tử/ml) 5 NSKC 0,02 d 10 NSKC 0,36 c 15 NSKC 0,62 b 21 NSKC 1,46 a CV 0,59 Mức ý nghĩa *
Số liệu thống kê đã được chuyển đổi sang log10
Ghi chú: trong cùng một cột, các trung bình có cùng mẫu tự theo sau giống nhau thì không khác biệt ý nghĩa qua phép thử Duncan.
*: khác biệt ở mức ý nghĩa 5%.
Theo Huỳnh Hữu Đức (2010), với cơ chất là gạo hoặc gạo trộn tấm đều cho ra kết quả không có khác biệt thống kê từ thời điểm 15 NSKC đến 19 NSKC, cho thấy với các nền cơ chất trên, nấm đã bước sang giai đoạn ổn định mật số (stationary phage). Điều này cho thấy, ở cùng một thời điểm từ 15 NSKC nghiệm thức được xử lý với dầu ăn kéo dài thời gian tăng sinh bào tử hơn so với thí nghiệm của Huỳnh Hữu Đức (2010). Khác biệt có thể là do dung dịch dầu ăn được chủng vào gạo tạo điều kiện thuận lợi hơn cho nấm phát triển.
25 Bảng 3.3. So sánh mật số bào tử giữa phương pháp chủng nấm truyền thống và phương pháp chủng nấm bằng kim tiêm
Nghiệm thức Mật số bào tử (x 10 9 bào tử/ml) 5NSKC 10NSKC 15NSKC 20NSKC PP A 0,27 0,90 1,37 1,42 PP B 0,02 0,36 0,62 1,46 T tính 26,37 5,92 4,42 -0,33 Mức ý nghĩa * * * ns
PP A: phương pháp chủng nấm truyền thống vào môi trường cơ chất. PP B: phương pháp chủng nấm bằng kim tiêm.
Số liệu thống kê đã được chuyển đổi sang log10
*: khác biệt ở mức ý nghĩa 5% ns: không khác biệt thống kê
Theo bảng 3.3 tại tất cả các thời điểm quan sát thì cả hai phương pháp chủng nấm đều có khả năng giúp nấm gia tăng sinh bào tử. Tuy nhiên, tại thời điểm 5, 10 và 15 NSKC thì số lượng bào tử của hai phương pháp có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Cụ thể, phương pháp chủng truyền thống cho thấy số lượng bào tử được sinh ra là nhiều hơn so với phương pháp chủng bằng kim tiêm, điều đó có nghĩa là phương pháp chủng truyền thống cho khả năng tăng sinh bào tử nhanh hơn so với phương pháp chủng bằng kim tiêm trong 15 ngày đầu sau khi cấy.
Ở thời điểm 20 NSKC, số lượng bào tử ở phương pháp chủng bằng kim tiêm có nhiều hơn ở phương pháp truyền thống, tuy nhiên không có khác biệt ý nghĩa thống kê. Bảng 3.3 cho thấy, mặc dù ở thời điểm 15 ngày đầu sau khi cấy phương pháp chủng truyền thống giúp tốc độ phát triển của nấm nhanh hơn phương pháp còn lại, tuy nhiên tại thời điểm 20 NSKC thì cả hai phương pháp cho ra số lượng bào tử tương đương nhau.
26
3.3. Khảo sát hiệu lực của chủng nấm xanh Ma từ phòng thí nghiệm NEDO và 5 chủng Ma (H1, H2, H3, H4, H5) từ Hungary trong điều kiện phòng thí nghiệm
Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy độ hữu hiệu của các chủng nấm tăng dần theo thời gian. Trong đó, độ hữu hiệu của chủng VN đạt 100% ở thời điểm 6 NSKC, chủng Ma H1, H2 và H3 đạt được được mức hữu hiệu 100% ở thời điểm 10 NSKC.
Vào thời điểm 2NSKC cho thấy tất cả các nghiệm thức đều có khả năng gây chết SKL. Kết quả thống kê không cho thấy sự khác biệt ý nghĩa giữa các nghiệm thức.
Bảng 3.4. Độ hữu biệu của các chủng nấm M. anisopliae lên sùng khoai lang trong điều kiện phòng thí nghiệm, bộ môn BVTV.
Nghiệm thức Độ hữu hiệu (%) tại các ngày sau khi cấy
2NSKC 4NSKC 6NSKC 8NSKC 10NSKC
H1 2,2 46,7a 92,5a 98,8ab 100a
H2 3,3 17,8 b 83,3 b 91,7 b 100a
H3 0,0 44,4a 94,1a 96,4ab 100a
H4 3,3 3,3 c 3,3 c 3,3 c 3,3 c
H5 1,1 2,2 c 2,2 c 2,2 c 2,2 c
VN 3,3 54,4a 100a 100a 100a
CV 53,59 23,24 11,61 10,65 5,10
Mức ý nghĩa ns ** ** ** **
Ghi chú: trong cùng một cột, các trung bình có cùng mẫu tự theo sau giống nhau thì không khác biệt ý nghĩa qua phép thử Duncan.
Số liệu thống kê đã được chuỷen đổi sang và arcsin **: khác biệt ở mức ý nghĩa 1%
ns: không khác biệt thống kê
Đến thời điểm 4 NSKC, độ hữu hiệu của các chủng nấm đối với SKL ở các nghiệm thức tăng lên từ 2,2% đến 54,4%. Các nghiệm thức có hiệu lực cao nhất là VN (54,4%), H1 (46,7%) và H3 (44,4%) và không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 1% nhưng khác biệt hoàn toàn với nghiệm thức H2 (17,8%), chủng nấm H4 và H5 cho thấy hiệu lực diệt sùng thấp nhất 2,2%.
27 Ở thời điểm 6 NSKC, nghiệm thức VN tỏ ra hiệu quả khi hiệu lực diệt sùng đạt 100%, tuy nhiên không có khác biệt thống kê với H1 (hiệu lực 92,5%) và H3 (hiệu lực 94,1%), cho thấy hiệu lực ở nghiệm thức H1 và H3 cũng khá cao. Ba nghiệm thức VN, H1 và H3 vẫn giữ mức hiệu lực cao hơn nghiệm thức H2 (83,3%) và hai nghiệm thức tỏ ra kém hiệu quả nhất vẫn là H4 (3,3%) và H5 (2,2%) ở mức ý nghĩa 1%.
Thời điểm 8 NSKC, có sự khác biệt giữa nghiệm thức VN (100%) với các nghiệm thức H2 (91,7%) và H4 (3,3%), H5 (2,2%) ở mức ý nghĩa 1%. Hiệu lực của H4 và H5 vẫn không tăng thêm kể từ thời điểm 4 NSKC.
Thời điểm 10 NSKC, nghiệm thức H1, H2, H3 và VN không có khác biệt ở mức ý