e/ Detector trong HPLC
2.2.2.4.Tính đặc hiệu:
Như trong phần 1.1.2 đã trình bày, các tạp chất cần xác định trong Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhưng trong điều kiện thí nghiệm không có chất chuẩn Jatrorrhizin, chúng tôi chỉ tiến hành xác định sự ảnh hưởng của tạp chất Palmatin đối với phương pháp định lượng
y = 1.052x - 0.008 R = 0.999 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 L î n g t ×m l ¹i ( g ) Lîng ho¹t chÊt cã thùc (g)
Tiến hành:
+ Cân 0,200 g chất chuẩn berberin clorid và hòa tan trong 200 ml nước bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml, thu được dunhg dịch berberin chuẩn 0,2 mg/ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào 4 bình định mức 100 ml.
+ Pha dung dịch Palmatin 10%, 5% và 2,5% so với nồng độ của berberin clorid đem đo
. Cân 0,02 g Palmatin chuẩn và hòa tan trong 20 ml nước bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nước đến 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dung dịch palmatin chuẩn 0,02 mg/ml
. Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,02 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, ta được dung dịch palmatin 0,01 mg/ml.
. Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,01 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dugn dịch palmatin 0,005 mg/ml.
. Lần lượt thêm 10 ml dung dịch palmatin 0,02; 0,01; 0,005 mg/ml vào 3 bình định mức 100 ml đã chứa berberin clorid chuẩn trên và thêm nước vừa đủ tới vạch. Một bình định mức 100 ml không thêm palmatin và thêm nước tới vạch. Đem đo độ hấp thụ quang của dung dịch 4 bình này tại bước sóng 421 nm
Bảng 4: Kết quả thu được về sựảnh hưởng của tạp chất palmatin tới
độ hấp thụ quang của berberin clorid
Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4 Berberin clorid 0,2 mg/ml
(ml) 10 10 10 10
Palmatin 0,02 mg/ml (ml) 10
Palmatin 0,005 mg/ml (ml) 10
Độ hấp thụ A 0,263 0,282 0,271 0.266
Nhận xét: Từ kết quả bảng trên, ta thấy độ hấp thụ quang của dung dịch tăng theo sự tăng của nồng độ dung dịch palmatin. Khi thêm 2,5% palmatin, hàm lượng berberin trong bột nguyên liệu định lượng theo phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS của DĐVN III tăng 1,14%. Nếu có 2% palmatin như trong giới hạn về palmatin mà DĐVN III yêu cầu thì kết quả định lượng tăng 0,91%
Vậy phương pháp không có tính đặc hiệu.
2.2.3. Định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005):
Điều kiện sắc ký để định lượng Berberin clorid nguyên liệu - Cột sắc ký: hạt nhồi silicagel được octadecylsilan hóa - Detector UV: 263 nm
- Pha động: đệm phosphate [ hỗn hợp KH2PO4 0,05M và heptan Na sulfonate(1:1) chứa 0,2% triethylamin, điều chỉnh pH=3,0 bằng H3PO4] – acetonitril (60:40).
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng thí nghiệm - Thể tích tiêm: 20ỡl
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút * Tiến hành:
+ Dung dịch thử: Cân 0,04 g berberin clorid hòa tan trong nước nóng, cho vào bình định mức 100 ml.Sau đó làm lạnh và thêm nước tới vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 ỡm, bỏ 8 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 2 ml dịch lọc trên cho vào bình định mức 25 ml , thêm nước tới vạch.
+ Dung dịch chuẩn : pha tương tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu berberin clorid
+ Tiêm lần lượt 10 ỡl dung dịch chuẩn và các dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, chạy sắc ký theo các điều kiện đã lựa chọn. Dựa vào diện tích hoặc chiều cao pic trên sắc đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử, nồng độ của dung dịch chuẩn, tính hàm lượng (%) Berberin clorid có trong mẫu thử theo công thức sau:
HL% = t c 83,30 c t S m S m × × × Trong đó: t
S : Diện tích pic mẫu thử
c
S : Diện tích pic mẫu chuẩn (Sc= 12,2646) c
m : Khối lượng cân mẫu chuẩn (0,0405 g) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
X : Khối lượng cân mẫu thử
83,30: Hàm lượng thực của mẫu chuẩn
Bảng 5: Kết quảđịnh lượng Berberin clorid nguyên liệu
STT Khối lượng cân (g) Diện tích pic (mAU.min) Hàm lượng (%)
1 0,0407 12,6917 85,78 2 0,0402 12,6120 86,30 3 0,0398 12,4224 85,86 4 0,0405 12,7101 86,32 5 0,0400 12,5350 86,20 Chuẩn 0,0405 12,2646 83.30 Theo kết quả ở bảng 5, ta có:
- Giá trị trung bình: X = 86,09 % - Độ lệch chuẩn: S = 0,254
- Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%): X (%) = 86,09% ±0,315%
- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = 0,295
Vậy theo phương pháp định lượng trên, hàm lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu là: 86,09% ±0,315%
2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005):