∗ Phương pháp tiêu cơ cá
Áp dụng theo Sổ tay phòng thắ nghiệm dự án FIBOZOPA - FIBOZOPA Lab manual, 2005.
- Pha dung dịch tiêu cơ gồm 6 gam pepsin và 8 ml HCl ựặc pha trong 1 lắt nước cất.
- Cân, ựo kắch thước từng cá thể cá. - Nghiền nhỏ từng cá thể cá.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 21
- đặt trong tủ ấm 37oC trong 2-3 giờ.
- Khi cơ tan hết tiến hành lọc: ựổ sản phẩm tiêu cơ qua lưới lọc có mắt lưới (1 x1) mm và rửa bằng nước muối sinh lý 0,86%.
- để lắng hỗn hợp trong vài phút, các bào nang metacercariae nặng sẽ lắng chìm xuống dưới, loại bỏ phần nước nổi bên trên, giữ lại phần lắng cặn.
- đưa phần lắng cặn vào ựĩa petri chứa nước muối sinh lý 0,86%, xoay nhẹ ựĩa cho các chất lắng cặn tập trung vào giữa ựĩa petri, dùng pipet loại bỏ phần nhẹ nổi trên mặt.
- Quan sát trên kắnh hiển vi soi nổi ựể ựếm số lượng metacercariaẹ - Chuyển metacercariae sang lam kắnh, nhỏ một giọt nước muối sinh lý, quan sát hình thái chi tiết dưới kắnh hiển vi có ựộ phóng ựại X20, X60, X100 ựể nhận dạng ấu trùng.
∗ Phương pháp mô bệnh học
Phương pháp chuẩn; sử dụng formalin 10% ựể cố ựịnh mẫu cá, ngấm parafin, ựúc khuôn, cắt bằng máy microtome với lát cắt dày 4-5 ộm, sử dụng dung dịch H&E ựể nhuộm tiêu bản sau ựó quan sát trên kắnh hiển vi, chụp ảnh.
∗ Kỹ thuật gây nhiễm chuột (Theo Helle Kay và ctv, 2008)
- Sử dụng kim gây nhiễm ựầu tròn lấy 40 ấu trùng sán H. pumilio sau khi phân lập ựược từ cá.
- Tay phải cầm kim có chứa ấu trùng sán, tay trái cầm chuột; ngón trỏ và ngón cái cầm chắc vào da phần gáy của chuột, ngón út kẹp chặt lấy ựuôi chuột.
- Kéo nhẹ phắa ựầu chuột giữ chặt cố ựịnh phắa ựuôi ựể sao cho chuột ở tư thế thẳng nhất.
- đưa nhẹ ựầu kim gây nhiễm vào miệng chuột, luồn qua hầu, thực quản ựến dạ dày và bơm hết dung dịch chứa metacercariae ra khỏi xi lanh.
Sau 7 ngày gây nhiễm, chuột sẽ ựược mổ ựể thu sán trưởng thành
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 22
- Mổ lấy toàn bộ ruột của chuột và tách ruột trong ựĩa petri có chứa nước muối sinh lý 0,86%.
- Cho ựĩa petri có chứa ruột vào tủ ấm ở nhiệt ựộ 37oC trong vòng 30 phút ựể sán trưởng thành thoát ra ngoàị
- Lọc rửa ruột bằng nước sạch rồi soi trên kắnh giải phẫu ựể tìm sán trưởng thành.
- đếm số lượng sán tìm ựược ở mỗi cá thể chuột.