4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1.2.1. Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học
Để quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học chúng tôi tiến hành phương pháp nhuộm kép 3 mẫu nấm men T1, T2, T3.
Cách tiến hành:
Lấy một lượng nhỏ mẫu tế bào nấm men từ ống thạch nghiêng T1, dàn đều trên lam kính có chứa một giọt nước cất.
Sau đó cố định tiêu bản bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn.
Nhuộm tiêu bản bằng thuốc tím kết tinh trong 5 phút, nhuộm lugol trong 1- 2 phút rồi rửa sạch bằng nước cất.
Tẩy bằng cồn trong 5 giây rồi lại rửa sạch bằng nước cất.
Sau đó nhuộm bổ sung fuchsin hay Safranin trong 1- 2 phút rồi rửa sạch bằng nước cất.
Cuối cùng hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để khô rổi quan sát tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần.
Làm tương tự đối với mẫu nấm men T2, T3.
Kết quả quan sát ta thấy, tế bào nấm men có hình ovan hoặc hình trứng. Trong đó mẫu T2 có kích thước tế bào lớn nhất. Kết quả thu được ở hình 3.3.
Hình 3.3. Mẫu hình dạng tế bào nấm men T2 quan sát dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần
3.1.2.2. Xác định hoạt lực lên men của các mẫu nấm men T1, T2, T3 bằng phương pháp cân trọng lượng bình
Cách tiến hành:
Các mẫu nấm men T1, T2, T3 được lên men ở môi trường lên men (MT3) trong các bình lên men có cùng dung tích 100ml với hàm lượng đường ban đầu là 220g/l, hàm lượng men giống ban đầu 10%, ở pH:4, nhiệt độ 26-
280C. Sau 48h, mở nắp bình lên men, đem cân trọng lượng bình một lần thấy trọng lượng bình giảm đi. Đó chính là lượng CO2 sinh ra trong quá trình lên men. Lượng CO2 sinh ra càng nhiều thì trọng lượng bình càng giảm, chứng tỏ hoạt lực lên men càng cao. Kết quả được thu được ở bảng sau:
Bảng 3.2. Hoạt lực lên men của các mẫu nấm men T1, T2, T3 sau 48h
Chủng nấm men T1 T2 T3
Lượng CO2 2,23±0,1 2,60±0,11 2,45±0,13
Nhận xét: Qua bảng 3.2. ta thấy mẫu T2 có hàm lượng CO2 thoát ra nhiều hơn mẫu T1, T3, chứng tỏ mẫu T2 có hoạt lực lên men mạnh nhất. Vì vậy, chúng tôi quyết định giữ mẫu T2 làm đối tượng nghiên cứu tiếp.
3.1.2.3. Khả năng lên men đường của mẫu T2
Để xác định khả năng lên men các loại đường của mẫu T2 chúng tôi sử dụng phương pháp lên men trong các bình lên men có thể tích 100ml bằng cách cấy mẫu T2 vào 3 loại môi trường lên men (mỗi môi trường ứng với một loại đường) với hàm lượng đường ban đầu là 220g/l, hàm lượng men giống 10%, ở pH:4, nhiệt độ 300C với thời gian lên men là 14 ngày.
Chúng tôi dựa vào một số chỉ tiêu sau để đánh giá khả năng lên men các loại đường là:
Hàm lượng đường sót. Hàm lượng cồn.
Lượng CO2 tạo thành.
Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại đƣờng của mẫu T2
Chỉ tiêu phân tích
Đơn vị Các loại đường
Glucose Saccarose Galactose
TG lên men ngày 14 14 14
HL đường sót % 4,8±0,2 6,5±0,2 11±0,2 HL cồn %V 11,5±0,2 10,2±0,2 5,5±0,2 HL CO2 g 2,1±0,1 1,1±0,1 0,2±0,1 pH 4,3 4,5 4,2 0 2 4 6 8 10 12
Glucose Saccarose Galactose
HL đường sót (%) HL cồn (%V) HL CO2 (g)
Hình 3.4. Khả năng lên men các loại đƣờng của mẫu T2
Nhận xét: Qua bảng 3.3 ta nhận thấy mẫu T2 có khả năng lên men mạnh nhất ở môi trường có đường glucose còn đối với môi trường có đường saccarose có khả năng lên men nhưng không mạnh và hầu như không có khả năng lên men đối với môi trường có đường galactose.
Kết luận: Sử dụng glucose là nguồn đường thích hợp nhất cho quá trình lên men vang táo mèo.
3.1.2.4. Xác định tên khoa học của mẫu T2
Căn cứ vào khóa phân loại của Lodder (1972), các hình ảnh ở trên và các kết quả thí nghiệm đối với mẫu T2 có đặc tính:
Sinh sản nảy chồi nhiều phía. Tế bào hình trứng, hình cầu, ovan.
Có khả năng lên men các loại đường như Saccharose….Đặc biệt là glucose
Điều kiện không thuận lợi hình thành 1- 4 bào tử. Mỗi nang chứa 2 bào tử.
Từ đó chúng tôi xác định được tên khoa học của mẫu nấm men T2 phân lập từ dịch táo mèo là Saccharomyces cerevisiae T2(S.cerevisiae T2).
3.2. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng S.cerevisiae T2 trong môi trƣờng nhân giống
Trong quá trình sản xuất rượu vang, giai đoạn nhân giống chiếm một thời gian ngắn 24h-28h nhưng lại có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tăng nhanh số lượng tế bào nấm men. Việc nghiên cứu động thái sinh trưởng, phát triển của chủng S.cerevisiae T2 là một phần trong quá trình sản xuất rượu vang.
Để xác định động thái phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae T2, tiến hành cấy giống vào môi trường nhân giống với số lượng tế bào ban đầu là 3,2x106 tế bào/ml nuôi trên máy lắc 150 vòng/phút ở 300C. Sau 6h lại kiểm tra số lượng tế bào 1 lần. Kết quả thu được ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khả năng sinh trƣởng, phát triển của chủng S.cerevisiae T2 trong môi trƣờng nhân giống.
TG (h) 0h 6h 12h 18h 24h 30h 36h 42h 48h
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0h 6h 12h 18h 24h 30h 36h 42h 48h SLTB
Hình 3.5. Động thái phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae T2 trong môi trƣờng nhân giống.
Nhận xét: Qua hình 3.5 ta thấy, số lượng tế bào trong 6h đầu tăng chậm. Lượng tế bào tăng nhanh từ 12h đến 24h. Từ 24h đến 30h số lượng tế bào tăng chậm, ổn định và đạt giá trị cực đại. Từ 36h đến 48h số lượng tế bào bắt đầu giảm. Sở dĩ trong 6h đầu số lượng tế bào tăng chậm là do đây là thời gian nấm men làm quen với môi trường. Từ 6h đến 24h, nấm men thực hiện quá trình trao đổi chất để sinh trưởng nên số lượng tế bào tăng nhanh. Khi nguồn dinh dưỡng giảm thì số lượng tế bào có tăng nhưng không đáng kể, ứng với thời điểm từ 24h- 30h. Khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, nấm men không có nguồn dinh dưỡng để sinh trưởng và sinh sản nên bị chết dần, đó là thời điểm 30h- 48h. Như vậy, quá trình sinh trưởng của chủng S.cerevisiaeT2 có thể chia thành 4 giai đoạn:
Giai đoạn từ 0h-6h ứng với pha tiềm phát. Giai đoạn từ 6h-24h ứng với pha logarit. Giai đoạn từ 24h-30h ứng với pha cân bằng. Giai đoạn từ 30h-48h ứng với pha suy vong. SLTBx106TB/ml
Mục đích của thí nghiệm là xác định thời gian nhân giống thích hợp và là cơ sở để nghiên cứu ảnh hưởng của một số nhân tố tới quá trình phát triển của chủng nấm men đã tuyển chọn S.cerevisiaeT2.
Kết luận: Từ kết quả trên tôi xác định thời gian nhân giống thích hợp nhất là 24h. Kết quả của tôi khi nghiên cứu về thời gian nhân giống đối với chủng S.cerevisiaeT2 phù hợp với một số tác giả [8,15].
3.3. Nghiên cứu động thái quá trình lên men vang táo mèo của chủng
S.cerevisiaeT2
Để xác định động thái lên men vang táo mèo chúng tôi tiến hành lên men trong các bình lên men có dung tích 500ml. Môi trường lên men là dịch siro táo mèo được pha loãng với nước cất để đạt hàm lượng đường ban đầu là 220g/l, hàm lượng men giống là 10% giống, ở pH: 4; nhiệt độ: 300C. Tiến hành phân tích mẫu 2 ngày 1 lần trong 14 ngày liên tục. Kết quả thu được ở bảng sau:
Bảng 3.5. Sự biến đổi hàm lƣợng đƣờng và cồn trong quá trình lên men vang táo mèo
Ngày 0 2 4 6 8 10 12 14
HL đường sót (%) 22 19 12 11 7,5 7 6,5 5,2 HL cồn (%V) 0 3 5 8 9 9,5 10,2 12
0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 8 10 12 14 HL đường sót (%) HL cồn (%V)
Hình 3.6 . Biểu diễn sự biến đổi hàm lƣợng đƣờng và cồn sau 14 ngày lên men
0 50 100 150 200 250 300 350 0 2 4 6 8 10 12 14 SLTB
Hình 3.7. Động thái lên men vang táo mèo của chủng S.cerevisiae T2
Nhận xét: Chủng S.cerevisiae T2 sinh sản nhanh nhất ở 2- 3 ngày đầu (pha sinh trưởng), duy trì ổn định ở ngày thứ 6- 7- 8 (pha cân bằng). Sau đó giảm dần vào các ngày sau do hàm lượng đường giảm mạnh, hàm lượng cồn tăng dần. Đó là do phần lớn đường được chuyển hóa thành rượu dẫn tới ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm men.
Hàm lượng acid tổng số cũng tăng dần nhưng không lớn lắm là do trong quá trình lên men rượu, ngoài việc tạo ra sản phẩm chính là rượu thì còn tạo nên các acid hữu cơ như acid acetic, lactic, xucxinic….Sự tạo thành acid trong quá trình lên men đã làm giảm độ pH của dịch lên men. Kết quả nghiên
SLTBx106TB/ml
Ngày Ngày
cứu về động thái lên men vang táo mèo đối với chủng S.cerevisiae T2 của tôi phù hợp với một số tác giả [14].
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng hàm lƣợng đƣờng tới quá trình lên men vang táo mèo
Đường là nguồn cacbon đóng vai trò quan trọng nhất trong việc tạo thành rượu trong vang táo mèo. Để nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường tới quá trình lên men vang táo mèo, chúng tôi chọn hàm lượng đường ban đầu ở các mức khác nhau là: 230g/l; 250g/l; 270g/l; 290g/l. Môi trường lên men được bổ sung với hàm lượng men giống 10%, pH:4, tiến hành lên men ở nhiệt độ 300C trong các bình lên men có dung tích 100ml. Kết quả thu được ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Khả năng lên men của chủng S.cerevisiae T2 trên môi trƣờng có hàm lƣợng đƣờng ở các mức khác nhau Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Hàm lượng đường (g/l) 230 250 270 290
TG lên men ngày 14 14 14 14
HL đường sót % 5,0±0,2 5,0±0,2 6,0±0,2 9,0±0,2 HL cồn %V 10,8±0,2 12,8±0,2 12,4±0,2 9,0±0,2 0 2 4 6 8 10 12 14 230 250 270 290 HL đường sót (%) HL cồn (%V)
Hình 3.8. Khả năng lên men của chủng S.cerevisiae T2 trên môi trƣờng có hàm lƣợng đƣờng ở các mức khác nhau
Nhận xét: Từ bảng 3.6 ta thấy trong môi trường có hàm lượng đường 25% thì lượng rượu tạo thành cao 12,8%, hàm lượng đường sót trong dịch lên men thấp chỉ còn 5%. Với mẫu có hàm lượng đường 29% thì nấm men phát triển kém, hàm lượng đường sót cao tới 9%, hàm lượng cồn tạo ra thấp 9%, do vậy rất khó bảo quản và ổn định chất lượng của vang trong quá trình tàng trữ.
Kết luận: Từ kết quả trên tôi xác định hàm lượng đường thích hợp cho quá trình lên men vang táo mèo đối với chủng S.cerevisiae T2 là 25%.
Kết quả của tôi phù hợp với tác giả Đinh Thị Kim Nhung khi nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men vang táo mèo [5].
3.5. Ứng dụng lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm
Qua kết quả nghiên cứu chúng tôi tiến hành lên men vang táo mèo ở quy mô phòng thí nghiệm đới với chủng S.cerevisiae T2 với hàm lượng đường ban đầu là 25%, hàm lượng men giống 10%, pH: 4, nhiệt độ 300
C trong bình lên men có dung tích 1000ml. Sau 14 ngày kết thúc giai đoạn lên men chính, đánh giá rượu thành phẩm sau đó chuyển tiếp sang lên men phụ. Kết quả phân tích được dẫn ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả phân tích rƣợu thành phẩm
Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Mẫu
Đường sót % 5
Độ rượu %V 13,5
Độ pH 4,2
Nhận xét: Rượu vang đạt chất lượng tốt với hàm lượng đường sót thấp 5%, hàm lượng rượu cao 13,5%, pH: 4,2. Ngoài ra, rượu trong có hương vị đặc trưng của táo mèo, khả năng kết lắng tốt. Kết quả trên là cơ sở để xây dựng quy trình sản xuất rượu vang táo mèo.
3.6. Quy trình công nghệ lên men vang táo mèo
3.6.1. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất vang táo mèo
Môi trường nhân giống Quả táo mèo chín
Giống Rửa sạch, bổ sung đường
Giống cấp 1 Dịch quả
Giống cấp 2 Môi trường lên men
Lên men chính ( 15- 17 ngày) Vang non Lên men phụ Lọc Tàng trữ Lọc Đóng trai
3.6.2. Thuyết minh công nghệ
Quy trình sản xuất vang táo mèo đầy đủ bao gồm 4 giai đoạn chính: Giai đoạn 1: Chế biến dịch lên men
Giai đoạn 2: Lên men chính
Giai đoạn 3: Lên men phụ ( ủ chín vang)
Giai đoạn 4: Hoàn thiện chất lượng và tiêu thụ sản phẩm
3.6.2.1. Giai đoạn 1: Chế biến dịch lên men
Quả thu hoạch về cần phải lấy những quả đã chín, loại bỏ các quả non, quả dập nát thối. Quả đã chọn đem rửa sạch bằng nước đạt tiêu chuẩn của vệ sinh rồi để ráo nước. Sau đó cho vào các thùng ngâm đường theo tỉ lệ 1:1. Quả táo mèo ta khía các đường nhỏ quanh quả. Khoảng 2 ngày khuấy trộn một lần. Sau một tháng ta thu được một thứ dịch siro nước hoa quả có nồng độ đường khoảng 60- 80% và nhiều dưỡng chất khác được chiết từ thịt quả.
3.6.2.2. Giai đoạn 2: Lên men chính
Bổ sung nấm men vào dịch lên men (thường ở tỉ lệ 5- 7%V). Điều chỉnh nhiệt độ phù hợp cho quá trình lên men vang táo mèo là 28- 300C, trong suốt quá trình lên men vang phải tiến hành phân tích mẫu và kiểm tra nấm men thường xuyên để điều chỉnh quá trình lên men cho phù hợp và để hạn chế sự thất thoát cồn, hương thơm… trong quá trình lên men chính, cần thiết phải lên men đầy bình, nên giữ áp lực ở mức thấp.
Quá trình lên men chính vang táo mèo thường kết thúc sau 15- 17 ngày.
3.6.2.3. Giai đoạn 3: Lên men phụ ( ủ chín vang)
Quá trình lên men phụ ( ủ vang) nên giữ ở nhiệt độ < 100C, sau khi kết thúc lên men vang được 80- 90 ngày có thể tiến hành tách cặn ở đáy bính sau đó có thể bổ sung phụ gia lắng trong bằng cách: pha loãng chất phụ gia với cồn (10- 15%V) và cho từ từ vào bình, vừa cho vừa khuấy theo một chiều cố
định trong khoảng 10- 15 phút. Việc tách cặn ở đáy bình phải tiến hành 2- 3 lần trong suốt thời gian tàng trữ.
3.6.3.4. Giai đoạn 4: Hoàn thiện và tiêu thụ sản phẩm
Để thăm cường giá trị cảm quan của sản phẩm ( nhất là độ trong) cần tiến hành lọc vang cho đến khi sản phẩm đạt đến độ trong hoàn thiện. Việc đóng chai và tiêu thụ sản phẩm thường được tiến hành ngay sau khi lọc vang lần cuối. Thông thường rượu rất có thể bị nhiễm ở khâu đóng chai, vì vậy các yêu cầu vệ sinh ở giai đoạn này phải hết sức nghiêm ngặt. Vang đóng chai có thể được cất giữ bảo quản trong thời gian dài.
Với điều kiện phòng thí nghiệm vi sinh hiện có và thời gian nghiên cứu còn hạn chế, chúng tôi đã làm được những bước chính:
Môi trường nhân giống
Giống
Giống cấp 1 Dịch quả
Giống cấp 2 Môi trường lên men
Lên men chính (15- 17 ngày)
Vang non
Lên men phụ
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Đã phân lập và tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men tốt, đặc biệt có khả năng lên men mạnh trong môi trường có đường là glucose với hàm lượng đường ban đầu là 25%, cho sản phẩm lên men có hàm lượng đường sót 5%, tạo được độ cồn là 13,5%V, pH:4,2 đạt tiêu chuẩn cho phép khi lên men rượu vang.
1.2. Đã nghiên cứu xác định được động thái của quá trình lên men vang táo mèo và thời gian nhân giống thích hợp đối với chủng S.cerevisiae T2 là 24h.
1.3. Đã tiến hành lên men vang táo mèo với quy mô phòng thí nghiệm và xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vang táo mèo.
2. Kiến nghị
Với kết quả thu được, chúng tôi mong muốn chủng nấm men đã được lựa chọn ở trên cùng với những kết quả nghiên cứu sẽ được áp dụng vào sản xuất rượu vang táo mèo ở Việt Nam, đem sản phẩm rượu vang táo mèo phù hợp với nhu cầu của người Việt Nam, góp phần làm phong phú nguồn hàng và tăng sản lượng rượu vang ở Việt Nam, đồng thời nhằm giải quyết những