Spectroscopy, NMR).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn là một phương phỏp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp cỏc kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, cỏc nhà nghiờn cứu cú thể xỏc định chớnh xỏc cấu trỳc của hợp chất, kể cả cấu trỳc lập thể của phõn tử.
Nguyờn lý chung của cỏc phương phỏp phổ NMR (Phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khỏc nhau của cỏc hạt nhõn từ (1H và 13C) dưới tỏc dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khỏc nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoỏ học (chemical shift). Ngoài ra đặc trưng của phõn tử cũn được xỏc định dựa vào sự tương tỏc spin giữa cỏc hạt nhõn từ với nhau (spin coupling).
1.5.3.1. Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoỏ học () của cỏc proton được xỏc định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoỏ của nguyờn tử cũng như đặc trưng riờng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoỏ học và tương tỏc spin mà ta cú thể xỏc định được cấu trỳc hoỏ học của hợp chất.
1.5.3.2. Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tớn hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyờn tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khỏc nhau và cho tớn hiệu phổ khỏc nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230ppm.
1.5.3.3. Phổ DEPT(Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer): Phổ này cho ta cỏc tớn hiệu phõn loại cỏc loại cacbon khỏc nhau. Trờn phổ DEPT tớn hiệu của cỏc cacbon bậc 4 biến mất. Tớn hiệu của CH và CH3 nằm về một phớa và của CH2 về một phớa trờn phổ DEPT 1350. Trờn phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tớn hiệu phổ của CH.
1.5.3.4. Phổ 2D-NMR: Đõy là cỏc kỹ thuật phổ hai chiều, cho phộp xỏc định cỏc tương tỏc của cỏc hạt nhõn từ của phõn tử trong khụng gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HMQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Cỏc tương tỏc trực tiếp H-C được xỏc định nhờ vào cỏc tương tỏc trờn phổ này. Trờn phổ, một trục và phổ 1H-NMR, cũn trục kia là 13C-NMR. Cỏc tương tỏc HMQC nằm trờn đỉnh cỏc ụ vuụng phổ.
- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn cỏc tương tỏc xa của H-H, chủ yếu là cỏc proton đớnh với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà cỏc phần của phõn tử được nối ghộp lại với nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đõy là phổ biểu diễn tương tỏc xa trong khụng gian phõn tử. Nhờ vào cỏc tương tỏc trờn phổ này mà từng phần của phõn tử cũng như toàn bộ phõn tử được xỏc định về cấu trỳc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn cỏc tương tỏc xa trong khụng gian của cỏc proton khụng kể đến cỏc liờn kết mà chỉ tớnh đến khoảng cỏch nhất định trong khụng gian. Dựa vào kết quả phổ này cú thể xỏc định cấu trỳc khụng gian của phõn tử.
Người ta cũn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences để xỏc định cấu trỳc khụng gian của phõn tử. Bằng việc đưa vào một xung đỳng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xỏc định thỡ cỏc
proton cú cựng phớa về khụng gian cũng như gần nhau về khụng gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tớn hiệu với cường độ mạnh hơn.
Ngoài ra, cũn sử dụng phổ X-RAY (Nhiễu xạ Rơnghen) để xỏc định cấu trỳc khụng gian của toàn bộ phõn tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Nhưng phạm vi sử dụng của nú hạn chế vỡ yờu cầu tiờn quyết của phương phỏp này là cần phải cú đơn tinh thể. Đõy là một điều kiện khụng phổ biến đối với cỏc hợp chất hữu cơ.
Như trờn đó đề cập, ngoài việc sử dụng cỏc loại phổ, người ta cũn sử dụng kết hợp cỏc phương phỏp chuyển hoỏ hoỏ học cũng như cỏc phương phỏp phõn tớch, so sỏnh kết hợp khỏc. Đặc biệt đối với cỏc phõn tử nhiều mạch nhỏnh dài, tớn hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khú xỏc định chớnh xỏc được chiều dài cỏc mạch. Đối với phõn tử cú cỏc đơn vị đường thỡ việc xỏc định chớnh xỏc loại đường cũng như cấu hỡnh đường thụng thường phải sử dụng phương phỏp thuỷ phõn rồi xỏc định bằng phương phỏp so sỏnh LC-MS hoặc GC-MS với cỏc đường chuẩn dự kiến.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. Mẫu thực vật.
Cõy Chiết cỏnh (Mallotus glabriusculus (Kurz) Pax et Hoffm thuộc họ Thầu dầu - Euphorbiaceae) được thu hỏi vào thỏng 01 năm 2011 tại Tam Đảo, Vĩnh Phỳc. Mẫu cõy được giỏm định tại Viện Sinh thỏi và Tài nguyờn sinh vật, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
Mẫu tiờu bản được lưu giữ tại Viện Hoỏ sinh Biển, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.2. Phương phỏp phõn lập cỏc hợp chất.
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC).
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trờn bản mỏng trỏng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18F254s (Merck). Phỏt hiện chất bằng đốn tử ngoại ở hai bước súng 254 nm và 368 nm hoặc dựng thuốc thử là H2SO4 10% được phun đều lờn bản mỏng, sấy khụ rồi hơ núng trờn bếp điện từ từ cho đến khi hiện màu.
2.2.2. Sắc kớ lớp mỏng điều chế.
Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trờn bản mỏng trỏng sẵn Silica gel 60 F254 (Merck, kớ hiệu 105875), phỏt hiện vệt chất bằng đốn tử ngoại hai bước súng 254 nm và 368 nm hoặc cắt rỡa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ núng để phỏt hiện vệt chất, ghộp lại bản mỏng như cũ để xỏc định vựng chất, sau đú cạo lớp Silica gel cú chất, giải hấp phụ bằng dung mụi thớch hợp.
2.2.3. Sắc ký cột (CC).
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường cú cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 àm, Fujisilisa Chemical Ltd.).